4.1. Quy trình trích ly (lấy ví dụ từ đậu nành)
Hình 2.7: Sơ đồ trích ly isoflavones từ đậu nành
Thuyết minh quy trình:
Từ mẫu có nguồn gốc từ đậu nành qua một số khâu xử lý mẫu: đồng hóa, nghiền, sấy, lạnh đông (đối với dạng mẫu lỏng: nước uống từ đậu nành,
…),thủy phân…ta thu được mẫu nguyên liệu đem trích ly.
Trích ly: có thể sử dụng các phương pháp truyền thống hoặc hiện đại đã nêu trên, sản phẩm sau khi trích ly sẽ qua một số khâu xử lý như: ly tâm, lọc, cô đặc, thủy phân, chiết lỏng cao áp,…
Sản phẩm sau khi tinh sạch được phân tích, định lượng bằng một số phương pháp: GC/GC-MS, HPLC/HPLC-MS,…
Ở đây ta tìm hiểu hiệu quả quá trình trích ly bằng sóng siêu âm:
Hiệu quả trích ly các hợp chất khi sử dụng sóng siêu âm tăng lên là nhờ sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua. Dưới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nén, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí nổ vỡ, tạo nên hiện tượng “sốc sóng”. Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy sự mất đối xứng, sinh ra tia dung môi có tốc độ cao vào thành tế bào, do đó làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào tế bào và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và pha lỏng. Điều này làm tăng sự truyền khối và phá vỡ cấu trúc tế bào. Sự nổ vỡ của các bọt khí làm tăng sự thoát ra của các chất nội bào vào dung dịch. Sử dụng nhiệt độ cao trong kĩ thuật UAE có thể làm tăng hiệu quả trích ly vì nó làm tăng sự hình thành và nổ vỡ các bọt khí.
Một vài thông số, cũng giống như trong các kĩ thuật truyền thống, có thể ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly các chất khi sử dụng sóng siêu âm như: sự phân cực và lượng dung môi, khối lượng và loại mẫu, thời gian trích ly và 1 số thông số của sóng siêu âm như: tần số, cường độ, số dao động sẽ ảnh hưởng lớn đến động lực trích ly.
UAE được sử dụng để trích ly isoflavone từ hạt đậu nành, thực phẩm chế biến từ đậu và từ nhiều nguồn cơ chất khác như đậu phụng, cỏ ba lá, rễ và cây sắn dây, rễ cây Hoàng kỳ, rễ cam thảo…
Một trong những nghiên cứu đầu tiên về trích ly isoflavone từ đậu được thực
Trang 20 Bảng 2.3. So sánh các kỹ thuật trích ly
hiện bởi Rostagno. Các yếu tố được khảo sát như dung môi, nhiệt độ, lượng mẫu và thời gian, những thông số quan trọng nhất là dung môi (lượng nước), nhiệt độ và thời gian trích ly.
Các yếu tố ảnh hưởng
4.1.1. Nguyên liệu
Tùy thuộc tính chất (nguyên liệu màng tế bào, chất nguyên sinh, một số tạp chất), trạng thái rắn lỏng, cách thức chuẩn bị mẫu nguyên liệu (kích thước) sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả trích ly.
Chẳng hạn, đối với kích thước vật liệu, quá trình trích ly xảy ra chủ yếu do thẩm thấu và khuếch tán nên kích thước vật liệu càng nhỏ, diện tích tiếp xúc càng lớn và hiệu quả trích ly càng cao. Nguyên liệu phải được xay nhỏ đến mức thích hợp để dung môi có điều kiện tiếp xúc trực tiếp với thành tế bào một cách dễ dàng, thúc đẩy quá trình chiết xuất nhanh chóng và nâng cao hiệu xuất chiết.
Bảng so sánh kỹ thuật trích ly dưới đây cũng cho ta thấy điều này. Đối với mẫu dạng mảnh (soy bits) khi sử dụng UAE lượng trích ly đạt được thấp hơn nhiều so với khi mẫu dạng bột (soy flour).
4.1.2. Dung môi
Lựa chọn dung môi trích ly: dung môi trích ly là các dung môi hoà tan được hợp chất cần trích ly. Khả năng đó của dung môi lại phụ thuộc một vài tính chất của nó như độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt...
Các isoflavone các hợp chất phân cực, nên chủ yếu sử dụng dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol, dd acid loãng…
Các tài liệu công bố thường sử dụng một số dung môi như: MeCN, EtOH, MeOH, ACE …
Trong đó một số nghiên cứu đã so sánh và cho các kết quả:
Một trong những nghiên cứu đầu tiên về trích ly isoflavone từ đậu được thực hiện bởi Rostagno. Các yếu tố được khảo sát như dung môi, nhiệt độ, lượng mẫu và thời gian, những thông số quan trọng nhất là dung môi (lượng nước), nhiệt độ và thời gian trích ly. Hiệu quả trích ly tăng khi sử dụng sóng siêu âm, tuy nhiên cũng còn phụ thuộc vào dung môi sử dụng. 50% EtOH, 50% MeOH, 40% MeCN đạt được tổng lượng iso flavone cao nhất. Dung môi thích hợp nhất cho từng loại iso flavone thì còn phụ thuộc vào cấu tạo hóa học của nó. Nói chung thì cho tất cả các loại thì hiệu quả trích ly cao nhất khi khi sử dụng dung môi với 40-60% lượng nước.
Achouri so sánh 3 dung môi: 80%MeCN + HCl 0,1N; 80% MeOH; 80%
EtOH để trích ly các cơ chất khác nhau (đậu tách béo, protein đậu nành) và thấy rằng 80% MeOH và 80% EtOH trích ly được lượng isoflavone cao nhất từ cả hai mẫu nguyên liệu. Quan sát thấy rằng sử dụng siêu âm để trích ly 15 phút nhiều bằng 5 lần trích ly bằng phương pháp lắc (tổng thời gian là 10h) (Hình dưới). Đây là theo dõi quan trọng, vì MeCN là một dung môi được sử dụng phổ biến trong kĩ thuật trích ly truyền thống, điều này chứng tỏ không sử dụng dung môi này cho trích ly bằng sóng siêu âm.
Hình 2.8: Ảnh hưởng của sóng siêu âm và việc rung lắc (sau 5 lần trích ly) lên tổng hàm lượng isoflavone từ SM và SPI với 3 loại dung môi khác nhau.
Gần đây, Bajer so sánh dung môi nguyên chất MeOH, MeCN, và ACE để trích ly De và Ge từ bột đậu nành. MeCN cho lượng cao nhất và được nghiên cứu thêm khi bổ sung 0-50% nước và 60% MeCN cho kết quả tốt nhất.
Lin và Giusti mô tả sự ảnh hưởng của tính phân cực dung môi và axit về hiệu quả trích ly của isoflavones từ đậu nành. Các tác giả tiến hành trích ly với sáu dung môi khác nhau phương pháp là một sự kết hợp của ba cực và hai mức độ acid hóa (83% ACN, 83% axit hóa ACN, 80% MeOH, 80% axit hóa MeOH, 58% ACN, và 58% axit hóa ACN). Dung môi axit hóa đã được chuẩn bị bởi 2ml trộn là 0,1 N HCl với 12 ml dung môi. Các tác giả đã chỉ ra rằng các dung môi có tính phân cực cao (Chỉ số phân cực, P '= 6,7-7,4) cung cấp hàm lượng isoflavones trích ly cao hơn từ đậu nành. Tính axít hóa trong các dung môi chuyển isoflavone liên kết thành aglycones tương ứng. Việc sử dụng các dung môi có tính axit nên tránh nếu mục đích của nghiên cứu là định lượng và đánh giá hoạt tính sinh học và sinh khả dụng của các hình thức khác nhau của isoflavone liên kết. Trong số sáu dung môi nghiên cứu, các tác giả quan sát thấy rằng 58% acetonitrile không bị axit hóa cung cấp hàm lượng isoflavones cao nhất mà không thay đổi cấu trúc liên kết của chúng
So sánh phương pháp trích ly truyền thống và trích ly có sử dụng sóng siêu âm để trích ly isoflavone từ bã rễ cây sắn dây:
Ethanol là dung môi trích ly, nó thường được sử dụng để trích ly các hợp chất thực phẩm vì nó an toàn cho sức khỏe. Và theo kết quả nghiên cứu dung môi với 80% ethanol và 20% nước cho hiệu quả trích ly cao nhất.
Bảng 2.4. ảnh hưởng của thời gian trích ly với sự khác nhau về thành phần dung môi đến sản lượng isoflavone trong phương pháp truyền thống và phương pháp sử dụng sóng siêu âm
Việc sử dụng ethanol-nước là dung môi trích ly vì sự liên quan đến độ phân cực, sự trưởng nở mô tế bào thực vật và tăng hấp thụ sóng siêu âm. Điều kiện tối ưu trích ly là 3 h khi sử dụng sóng siêu âm 40kHz ở 800C. Áp dụng sóng siêu âm ở 800C, dung môi nước-ethanol làm tăng lượng chất trích ly được gấp 3 lần so với khi không áp dụng ở 250C và 1,6 lần ở 800C. Lượng cực đại thu được là 7,28g isoflavone từ 100g bột rễ thải khi sử dụng song siêu âm với dung môi ethanol-nước (80:20) ở 800C trong thời gian 6h.
Sự thay đổi hóa học của isoflavones có thể xảy ra trong qui trình trích ly.
Cần có một dung môi đặc biệt để sự chuyển đổi là ít nhất.
Nồng độ β-glucosides và acetyl glucosides có thể được tăng lên hoặc bị giảm bớt trong quy trình, aglycones có thể tăng lên vì đó là hệ quả của sự chuyển đổi hóa học. Một lượng lớn những hợp chất hóa học đạt được này không có nghĩa là đạt được hiệu quả trích ly cao mà đó chỉ là kết quả của sự chuyển đổi hóa học. Vì vậy thật khó để xác định dung môi hiệu quả nhất cho sự trích ly β-glucosides, acetyl glucosides và aglycones bằng cách so sánh lượng chất thu được thông thường.
Malonyl isoflavone là dạng hợp chất hóa học dễ bị giảm phẩm chất, vì thế nếu đạt
được một lượng lớn malonyl isoflavone trong nguyên liệu được trích ly chứng tỏ hiệu quả trích ly của dung môi cao, cũng như là quá trình ngăn ngừa những chuyển đổi hóa học tốt hoặc là cả hai điều này. Trong trường hợp không xác định được lượng malonyl glucosides thì lựa chọn tốt nhất là xác định tính ổn định của nó trong suốt quy trình xử lí.
Nói về dung môi thì thường được nói về mặt thuận lợi và không thuận lợi. Ví dụ: MeCN thường thường có thể trích li được nhiều isoflavone hơn MeOH và EtOH, tuy nhiên, giá thành cao, độc, tính thân thiện với môi trường thấp hơn MeOH và EtOH.
4.1.3. Kỹ thuật trích ly Nhi
ệt độ và th ờ i gian:
Nhiệt độ trích ly có mối liên hệ với hiệu quả trích ly: Nhiệt độ tăng thì làm tăng lượng isoflavone thu được. Tuy nhiên, nhiều hợp chất isoflavone không bền nhiệt và có thể bị giảm chất lượng trong suốt quá trình trích ly đó, điều này ảnh hưởng trực tiếp đến các hoạt tính sinh học của isoflavone.Ngoài ra, nhiệt độ cao còn tăng trích li protein, pectin, là những thành phần tạo bọt. Theo thống kê ở một số nghiên cứu thì thấy rằng khoảng nhiệt độ cho trích ly isoflavone thường từ (40- 800C). ví dụ: trích ly isoflavone từ mẫu nước uống đậu nành (hình 2.9 ), ở 450C cho lượng cao nhất.
tách.
Hình 2.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả trích ly isoflavone từ thức uống từ đậu nành
Tuy nhiên cần lưu ý để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm oxi hóa chất cần
Thông thường, các phương pháp cho thấy đạt được nhanh và trích ly đủ số
lượng trong 20 phút. Để kiểm tra số lượng thu được, kết quả được lặp lại 5 lần để so sánh mà không có sai khác. Hầu hết (80-90%) isoflavone trong bột đậu được trích ly trong 10 phút. (Griffith và Collison). Kéo dài thời gian trích ly 30 phút làm giảm một lượng isoflavone.
Rostagno quan sát sự giảm hiệu quả trích ly khi lượng nước cao >60%, nó được cho là do làm tăng các sản phẩm của rễ hòa tan vào nước dưới tác dụng của sóng siêu âm. Với báo cáo này, có sự giảm nhẹ lượng isoflavone tổng số đạt được khi trích ly 30 phút với 50% EtOH ở 600C so với khi trích ly trong 20 phút.
Achouri cũng có kết luận tương tự, ông quan sát và trong trường hợp này, tổng lượng isoflavone giảm nếu trích ly từ 15-30 và 60 phút. Như vầy, nên trích ly với thời gian ngắn khi sử dụng sóng siêu âm.
S
ố l ầ n trích ly
Tùy thuộc vào mẫu nguyên liệu và phương pháp trích ly, số lần trích ly sẽ ảnh hưởng đến lượng isoflavone thu được. Chẳng hạn, theo nghiên cứu của Allaoua Achouri, Joyce Irene Boye *, Denis Belanger về ảnh hưởng của số lần trích ly isoflavone trong đậu nành:
Tổng lượng isoflavones sau một lần trích ly (E1) bằng dung môi được đưa ra ở hình 2.
Lặp lại trích ly 5 lần tăng được lượng isoflavone mỗi loại 56%, 61%, 56%, 53%, 42%, 54%, 100%, 60% và 83% ở mẫu SM cho daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein, malonyldaidzin, malonyl-glycitin and malonyl- genistin, (Bảng dưới). Đối với mẫu SPI cũng vậy.
Lần trích ly thứ hai hầu hết sản lượng isoflavones nhiều như lần thứ nhất, và sau lần trích ly thư năm tổng lượng tăng lên xấp xỉ 123%, 119%, 120%, 128%, 89%, 101%, 101%, 153% và 142% cho từng loại tương ứng daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein, malonyl-daidzin, malonylglycitin và malonyl-genistin.
Với các dung môi được sử dụng, lượng isoflavones tổng số sau năm lần trích ly (so sánh với chỉ sau một lần) thì tăng 74%, 69% và 65% đối với mẫu SM; 147%,
103% và 107% đối với mẫu SPI, sử dụng dung môi acetonitrile, methanol và ethanol.
Hình 2. 10:Tổng lượng isoflavone trong mẫu bột đậu nành (SM) và protein đậu nành (SPI) sau một lần trích ly (E1) và năm lần trích ly (E5)
Những kết quả này khẳng định rằng một lần trích ly isoflavones được đề cập như phương pháp nêu trên thì nồng độ isoflavones trích ly được thấp hơn định lượng . Sự khác nhau về sản lượng isoflavones trích ly được ở mẫu SM và SPI thì rất thú vị.
Với mẫu giàu protein (SPI), sau 1 lần trích ly chỉ đạt 41% isoflavone so với 58% ở mẫu có hàm lượng protein thấp (SM), sử dụng dung môi ACN–HCl. Điều này có thể do tương tác của protein–polyphenol trong mẫu SPI. Trong bài báo (Boye, 1999) nói rằng có rất nhiều sự tương tác bao gồm liên kết hydrogen, ionic và liên kết cộng hóa trị và chủ yếu là tương tác kị nước với hợp chất protein–polyphenol.
Nhứng sự tương tác này bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi nhiệt độ, pH, nồng độ muối...
Bảng 2.5 : Ảnh hưởng của số lần trích ly đến lượng các isoflavone từ mẫu bột đậu và protein đậu nành sử dụng 3 dung môi
Công su ấ t siêu âm:
Dựa vào kết quả nghiên cứu của XU Huaneng, ZHANG Yingxin và HE Chaohong, ta thấy, công suất điện đầu vào càng cao thì hàm lượng trích ly isoflavone đạt được càng cao (hình minh họa).
Hình 2.11 Ảnh hưởng của công suất điện đến hiệu quả trích ly isoflavone Khu ấ y tr ộ n:
Trích ly lỏng – rắn là cần thiết cho sự phân đoạn các cấu tử từ nguyên liệu tự nhiên. Nhưng hiệu suất trích ly lỏng – rắn rất thấp bởi vì tốc độ truyền khối thấp. Sự khuấy đảo thường được dung để làm tăng tốc độ truyền khối nhưng tác động của sự khuấy đảo lên quá trình truyền khối rất giới hạn. Nguyên nhân chính là tốc độ trích ly được kiểm soát không chỉ bởi tốc độ truyền khối trong màng lỏng quanh mẫu trái cây mà còn bởi tốc độ khuếch tán bên trong. Kết quả là, sự khuấy không ảnh hưởng đến tốc độ trích ly khi trở lực truyền khối trong màng lỏng giảm đến một phạm vi nào đó tốc độ trích ly chỉ bị kiểm soát bởi sự khuếch tán bên trong.
Tỷ
lệ nguyên liệu: dung môi : tỷ lệ nguyên liệu : dung môi càng nhỏ thì hiệu quả quá trình trích càng cao. Tuy nhiên, cần thiết phải nghiên cứu nhiều tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (SSR) thấp hơn để xác định SSR mà tại đó nó không tăng nữa ở các mức độ trích ly. Điều này đảm bảo việc sử dụng dung môi tiết kiệm nhất và hiệu quả nhất.
Ngoài ra tùy theo chất cụ thể mà còn nhiều yếu tố khác: PH, sử dụng chất kháng oxy hóa hỗ trợ, nhiệt độ nguyên liệu…
5. KẾT LUẬN
Tóm lại có nhiều phương pháp trích ly các loại isoflavone, đối với phương
pháp truyền thống có một số nhược điểm sau:
+ Sử dụng một lượng dung môi lớn, thường độc, và chi phí cao.
+ Thời gian chiết kéo dài, độ chọn lọc không cao.
+ Trích ly với nhiệt độ cao và thời gian kéo dài ảnh hưởng chất lượng sản phẩm.
Các phương pháp hiện đại có nhiều ưu điểm hơn hẳn phương pháp truyền thống.
+ Giảm lượng dung môi sử dụng, giảm phế thải.
+ Dung môi xanh, độ chọn lọc cao, dễ thu hồi.
+ Giảm thời gian chiết.
+ An toàn, hiệu quả, dễ tự động.
+ Có thể kết hợp các phương pháp phân tích trực tuyến.
Qua những tìm hiểu, ta thấy UAE là phương pháp đầy triển vọng với hiệu suất trích ly cao được minh chứng rõ ràng qua bảng tham khảo về việc so sánh các kỹ thuật trích ly isoflavone từ các sản phẩm đậu nành (đặc biệt hiệu quả cao đới với dạng bột) dưới đây.
Bảng 2.6: So sánh hiệu quả trích ly isoflavone của các phương pháp
Kĩ thuật trích li isoflavone từ đậu nành và thực phẩm chế biến từ đậu sử dụng sóng siêu âm cho hiệu quả tốt, có thể trích ly được lượng cao, thời gian chưa đầy 30 phút từ nhiều loại mẫu khác nhau với những dung môi thông thường. Rõ ràng, nhiệt độ cao thời gian trích ly sẽ ngắn và tỉ lệ nước ở mức trung bình cho đến mức cao