3.3 Các lý thuyết chuyển pha áp suất — nhiệt độ đối với các đại phân tử
3.3.1 Giản đồ pha dạng Elliptic của Protein
Protein tồn tại ở hai trạng thái khác nhau đó là dạng nguyên thể và dạng biến tính và chuyển qua lại giữa hai trạng thái. Ta khảo sát quá trình co - duỗi của protein như hai trạng thái đơn giản, nhiệt động lực học mô tả hai quá trình trên dựa trên năng lượng tự do khác nhau giữa hai trạng thái nguyên thể và trạng thái duỗi ra của protein. Năng lượng tự do Gibbs giữa hai trạng thái là:
∆G=Gdenatured−Gnative
= ∆S∆T + ∆V∆p. (3.3.1)
Độ biến thiên năng lượng tự do có thể âm khi và chỉ khi quá trình kéo theo sự sụt giảm năng lượng tự do trong quá tình biến đổi từ trạng thái nguyên thể đến trạng thái biến tính. Các hệ thống không ổn định (G cao hơn) có xu hướng biến đổi về trạng thái ổn định hơn (Gthấp hơn) chính là trạng thái cân bằng. Để cho hệ ở trạng thái cân bằng thì năng lượng tự do đạt giá trị cực tiểu.
Ta có
d∆G=−∆SdT + ∆Vdp. (3.3.2) Ta thấy năng lượng tự do Gibbs của tất cả trạng thái của protein đều phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Lấy tích phân phương trình trên và chọn các điểmT0, p0
đến T, p tùy ý, thu được
∆G= ∆G0−∆S0(T −T0)−∆Cp
T
ln T T0 −1
+ ∆V0(p−p0) + ∆β
2 (p−p0)2+ ∆α(T −T0) (p−p0),
(3.3.3)
trong đó: ∆ là sự thay đổi của các thông số tương ứng trong quá trình biến tính (ví dụ độ biến thiên ∆G bằng giá trị năng lượng tự do trạng thái biến tính trừ đi trạng thái nguyên thể). β là hệ số nén đẳng nhiệt được xác định bằng công thức: β = ∂V∂p
T; α là hệ số giãn nở đẳng nhiệt được xác định bằng công thức:
α=∂V∂T
p =−∂S∂p
T ;Cp là nhiệt dung riêng đẳng áp:Cp =T∂S∂T
p.
Trong vùng lân cận của một điểm gốc có thể sử dụng phép gần đúng bậc 2, ta thu được:
T
ln T T0
−1
+T0 = (T −T0)2 2T0
. (3.3.4)
Thay vào phương trình (3.3.3) ta được:
∆G= ∆G0−∆S0(T −T0)−∆Cp
2T0 (T −T0)2+ ∆V0(p−p0) + ∆β
2 (p−p0)2+ ∆α(T −T0) (p−p0).
(3.3.5)
Đường cong chuyển pha, nơi protein biến tính được xác định bởi ∆G = 0. Thế vào phương trình (3.3.5) thu được phương trình biểu diễn đường cong thứ hai trong đồ thịp−T.
∆G0−∆S0(T −T0)− ∆C2Tp
0 (T −T0)2+ ∆V0(p−p0) +∆β2 (p−p0)2+ ∆α(T −T0) (p−p0) = 0.
-2 0
2 4
T
-2 0
2
4 p
-10 -5
0
G
Hình 3.3.1: Năng lượng tự do Gibbs của sự duỗi như hàm số của áp suất và nhiệt độ. Phần ellipse tô đậm ở trên mặt cắt thể hiện đường cong chuyển tiếp khi ∆G= 0. Bên trong hình ellipse trạng thái nguyên thể, bên ngoài ellipse là trạng thái co bền vững.
Về mặt toán học, nó là phương trình tổng quát của mặt bậc 2, nó có thể là một papabola hay một ellipse, nhưng bằng thực nghiệm, người ta đã khẳng định rằng nó luôn có hình dạng ellipse đối với protein. Theo toán học, để đảm bảo nó là hình ellipse thỏa mãn điều kiện:
∆α2 > ∆Cp∆β T0
, (3.3.6)
đã được chứng minh bởi các dấu hiệu khác nhau của ∆Cp và ∆β trong trường hợp chymotrypsinogen và ribonuclease A được nghiên cứu bởi Hawley [10].
Vế phải của phương trình (3.3.5) cho ta một parabol ellip của ∆Gnhư hình 3.3.1.
Mặt cắt phía trên là hình chiếu của phương trình trên đồ thị p−T, cho thấy nguồn gốc của sơ đồ pha ellipse. Miền - nơi protein ở trạng thái bền vững trong pha nguyên thể ∆G > 0 được thể hiện bằng màu xám. Vậy các hình màu xám cho biết protein ở trạng thái nguyên thể.
Khai triển chuỗi Taylor dừng lại gần đúng bậc hai, tức là lấy đạo hàm bậc hai của độ biến thiên năng lượng tự do Gibbs ∆Gkhi nhiệt độ và áp suất không đổi:
∂∆C
p
∂T
p = 0,
∂∆β
∂T
p =∂∆α∂T
p = 0,
∂∆β
∂p
T = 0,
∂∆α
∂p
T =∂∆C∂pp
T = 0.
(3.3.7)
Mặc dù điều kiện của phương trình (3.3.7) thường được cho là thích hợp nhưng không phải là luôn luôn đúng, sẽ có một số trường hợp là không phù hợp nữa. Cụ thể, Yamaguchi đã viết báo cáo sự phụ thuộc của ∆G vào áp suất trong trường hợp của ribonuclease A tham khảo trong [18]. Phép phân tích mở rộng của độ biến thiên năng lượng tự do theo nhiệt độ và áp suất của phương trình ∆G(T, p) là rất cần thiết, số hạng bậc ba của phương trình cũng được tính đến (có thể tham khảo trong [12]). Hình 3.3.2 cho thấy giản đồ pha bị biến dạng khi đưa vào các số hạng tỉ lệ T3, T2p, T p2, và p3. Theo ý nghĩa vật lý, các số hạng này là nhiệt độ và áp suất phụ thuộc vào ∆Cp, ∆β, ∆α. Hình dạng đường cong chính là ellipse rõ ràng không bị bãi bỏ, nhưng trên thực tế là hình dạng đường cong méo. Như người ta mong đợi, đặc biệt là ở phần méo của ellipse là tại nhiệt độ cao hoặc áp suất cao, nơi mà các số hạng trên có giá trị lớn.
Như vậy, đường biên giới giai đoạn méo đã được quan sát thấy, và nó liên quan đến giới hạn của lý thuyết đằng sau giản đồ pha elliptic [22].
Khảo sát một số điểm cụ thể trên giản đồ pha elliptic. Tại nhiệt độ biến tính
Hình 3.3.2: Ảnh hưởng của số hạng bậc cao hơn trên hình dạng của giản đồ ellipse. Ảnh hưởng của các số hạng (a) T3; (b)T2p; (c) T p2; (d) p3. Đường nét liền thể hiện sơ đồ pha ban đầu; đường chấm chấm thể hiện sơ đồ pha nếu như các số hạng trên được đưa vào phương trình.
Các mũi tên cho thấy hướng của sự biến dạng khi các số hạng bậc cao tăng lên.
Th ( ở áp suất khí quyển), áp suất biến tính pd (ở nhiệt độ phòng) và nhiệt độ biến tính lạnh Tc là ba điểm được quan tâm nhất. Chúng được xác định bởi các phương trình sau:
Th =−∆S0T0
∆Cp
+
v u u t
∆S02T02
∆Cp2 + 2∆G0T0
∆Cp
+T0, (3.3.8)
pd=−∆V0
∆β +
v u u t
∆V02
∆β −2∆G0
∆β +p0, (3.3.9)
Tc=−∆S0T0
∆Cp −
v u u t
∆S02T02
∆Cp2 + 2∆G0T0
∆Cp +T0. (3.3.10)
Chọn điểmT0, p0 tùy ý, để đơn giản chúng ta chọn T0 là nhiệt độ phòng và p0 là áp suất khí quyển.
Hệ số góc của ranh giới pha trên một điểm tùy ý của hình ellipse có thể được
viết dưới dạng sau:
∂p
∂T =−
∂∆G
∂T
∂∆G
∂p
= ∆S0−∆α(p−p0) + ∆CpT−TT 0
0
∆V0+ ∆β(p−p0) + ∆α(T −T0),
(3.3.11)
hoặc theo phương trình Clausius - Clapeyron
∂p
∂T =−
∂∆G
∂T
∂∆G
∂p
= ∆V0+ ∆β(p−p0) + ∆α(T −T0)
∆S0−∆α(p−p0) + ∆CpT−TT 0
0
.
(3.3.12)
Hình 3.3.3: Vị trí tương đối của đường ∆S = 0 và ∆V = 0 trên ellipse.
Khi áp suất và nhiệt độ có giá trị lớn nhất, tại đó trạng thái nguyên thể của protein là ổn định, hệ số góc của ellipse bằng 0 và vô hạn tại pmax và Tmax.Theo phương trình Clausius - Clapeyron, ta có khi ∆V = 0 thì (cho điểm của)Tmax và khi ∆S = 0 (cho điểm của) thìpmax. Đường ∆V = 0 là đường thẳng đi qua trung tâm của ellipse. Tương tự đường ∆S = 0 cũng là đường thẳng. Những đường thẳng này được xác định bởi các phương trình:
p∆S=0 = ∆Cp
∆α
T −T0
T0 +∆S0
∆α +p0, (3.3.13)
và
p∆V=0 = ∆α
∆β(T −T0) + ∆V0
∆β +p0. (3.3.14)
Hình 3.3.3 thể hiện các đường cho trường hợp tổng quát của hình ellipse. Đó là những đường entropy hoặc đường thể tích thay đổi hưởng tích cực đến sự duỗi ra của protein. Dưới đường ∆S = 0, các đường ∆S theo thứ tự giảm dần trong suốt quá trình protein biến tính. Trên đường ∆V = 0, thể tích giảm góp phần làm cho ∆G đẩy mạnh quá trình protein duỗi ra.
Hình 3.3.4: Giản đồ pha p−T áp dụng cho chymotrypsinogen (a), ribonuclease (b).
Thực tế, hình dạng, kích thước và hướng của đường biên giới của elliptic được định nghĩa bởi 6 thông số nhiệt động là (∆β, ∆α, ∆Cp, ∆V0,∆S0, ∆G0). Sự giảm của ∆Cp mở rộng hình ellipse theo hướng của trục nhiệt độ. Tương tự như vậy sự giảm ∆β theo hướng của trục áp suất. ∆α xác định chủ yếu hướng của
ellipse.
Các giản đồ pha của chymotrypsinogen và ribonuclease được xác định bởi Hawley khác nhau rõ rệt trong hình dạng của chúng (Hình 3.3.4). Trong khi giản đồ pha của chymotrypsinogen cho thấy một ảnh hưởng ổn định của áp suất trung bình chống lại sự biến tính nhiệt hệ số góc của đường cong, dpdp >0 tại điểm Th), áp suất giảm ribonuclease duỗi ra vì nhiệt. Các giản đồ pha trên của protein có thể được phân loại dưới hai hình thức, một là của chymotrypsinogen trông giống như
”cái lưỡi” và dạng hai là của ribonuclease như ”sườn đồi”.