2.4.1. Xác định độ ẩm của mẫu cần phân tích
Tiến hành
Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0)
Cân mẫu Rx chính xác đến 0,001 g, cho vào cốc trên (m1)
20 g Vỏ tôm đã được xử lý
Ủ 70 oC trong 24 giờ
NaOH 1 M với tỉ lệ 15mg/l
Lọc
Thu cặn
Xác định hàm lượng N tổng số.
Để cốc có chứa mẫu Rx vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 ºC ± 2 ºC thời gian 3 giờ.
Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác đến 0,001 g (m2). Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đến khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 2 mg hoặc 4 mg tuỳ theo khối lượng của phần mẫu thử.
Tính toán
Độ ẩm tính bằng % khối lượng được tính theo công thức sau:
Độ ẩm (%)=([m1 – m2] * 100)/(m1 – mo) Trong đó:
mo : khối lượng cốc không (g)
m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) m2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)
2.4.2. Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu phân tích
Tiến hành
Cho chén nung vào tủ sấy trong 2 giờ. Sau đó lấy chén ra và làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001 g (mo). Cân khoảng 2 g mẫu Rx ở trạng thái khô không khí và cho vào chén nung đã biết khối lượng với độ chính xác 0,001 g.
Cho chén và mẫu vào tủ sấy, sấy ở 105 oC trong 2 – 3 giờ để cho nước có
trong mẫu bay đi hết, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 500 – 550 ºC trong 2 giờ.
Lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng m2.
Kết quả
Hàm lượng tro thô của mẫu Rx được tính bằng % theo công thức:
X = ([m2 – m0] *100) /m1
Trong đó:
X : hàm lượng tro thô của mẫu (%).
m2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g).
m0 : khối lượng chén (g).
m1 : khối lượng mẫu thử trước khi nung (g).
2.4.3. Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men
Độ acid được xác định bằng cách trung hòa với NaOH, sử dụng thuốc thử
phenolphtalein
Tiến hành
Cho 30 ml dịch Dx vào bình tam giác, thêm 3 giọt phenolphtalein.
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi dịch chuyển sang màu hồng tím.
Kết quả
% Khối lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức:
%g acid lactic = VNaOH/30*50/10*0.1/1000*90*100 Trong đó:
VNaOH: thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ được.
30: số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ.
50: tổng số ml dịch Dx.
0,1: nồng độ NaOH dùng chuẩn độ.
1000: hệ số chuyển đổi ra g.
90: mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx.
2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch sau lên
Tiến hành
Cho vào bình 10 ml dung dịch Dx, 15 giọt chit thị hỗn hợp, chỉnh độ pH bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi màu xanh xuất hiện.
Cho thêm 5 ml formol trung tính, lúc này dung dịch có màu vàng rơm. Chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi xuất hiện màu tím.
Mẫu trắng: thực hiện như trên, thay 10 ml Dx bằng 10 ml nước cất.
Tính kết quả
𝑁𝑎𝑚𝑖𝑛 =(𝑛1−𝑛2)×0,007×50×1000 10×10
Trong đó:
N amin: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg/g).
n1: số ml NaOH 0,05 N để chuẩn độ mẫu thí nghiệm.
n2: số ml NaOH 0,05 N để chuẩn độ mẫu trắng.
0,007: số g N amin tương ứng với 1ml NaOH 0,05N.
50: số ml dung dịch mẫu Dx ban đầu.
1000: hệ số chuyển đổi mg ra g.
10: số ml dung dịch Dx đem chuẩn độ.
10: số g nguyên liệu ban đầu.
2.4.5. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch sau lên men bằng phương pháp Bradford
Nguyên tắc
Các protein khi phản ứng xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ
hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiợ̀n tới vài àg protein/ml, dờ̃ thực hiợ̀n và tiờ́t kiợ̀m thời gian.
Tiến hành Lập đồ thị chuẩn
Đờ̉ dung dịch albumin có nụ̀ng đụ̣ từ 10-50 àg/ml ta thực hiợ̀n như sau:
Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn
Số ống ĐC 1 2 3 4 5
Nụ̀ng đụ̣ albumin (àg/ml) 0 10 20 30 40 50
Vml albumin 0 1 1 1 1 1
Vml H2O 1 0 0 0 0 0
Coomassie(ml) 2 2 2 2 2 2
Mẫu thí nghiệm: hút 0,1ml dịch Dx và 5ml thuốc thử Coomassie.
Ủ mẫu 20 phút và đo OD ở bước sóng 595nm.
Kết quả
Từ kết quả đo OD vẽ ra đồ thị đường chuẩn albumin dạng y = ax + b Hàm lượng N protein (mg/g) =([y-b]/a)*50/10/6,25
Trong đó:
y là kết quả OD của mẫu thí nghiệm
a và b là hai hằng số trong đường chuẩn albumin.
50: số ml dịch Dx.
10: số g nguyên liệu ban đầu.
6,25: hệ số chuyển đổi từ protein hoà tan sang N protein.
2.4.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số có trong vỏ tôm sau khi lên men
Tiến hành Vô cơ hóa mẫu
Cân 0,2 g mẫu bột vỏ tôm cần xác định N tổng, cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5 ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxy hóa). Cho thêm vào 0,2 g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh.
Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở
trên thành bình còn chưa bị oxi hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.
Cất đạm
Chuyển 25 ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50 ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng.
Tiếp tục cho vào bình cất 20 ml NaOH 45 % cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5 ml NaOH 45 % nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20 ml H2SO4 0,1 N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có
làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 45 %.
Sau khi cất đạm 20 – 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được.
Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
Chuẩn độ
Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.,1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ, ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng.
Tính kết quả:
Khối lượng nitơ tổng số có trong mẫu được tính theo công thức:
N (g) = [{1,42 * (V1-V2)*100/a}*4/1000]*10/100 Trong đó:
V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng.
V2: số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ.
a: số g nguyên liệu đem vô cơ hoá mẫu.
1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ.
2.4.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men Hàm lượng N tổng trong dịch sau lên men (mg/g) được tính bằng công thức N tổng trong dịch (mg/g) = N protein (mg/g) + N amin (mg/g)
2.4.8. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp DNS
Tiến hành
Lập phương trình đường chuẩn D – glucose:
Cân 1 g D – glucose tinh khiết 99 % pha loãng với nước cất đến 100 ml (dung dịch 1)
Bảng 2.3. Phương pháp lập đường chuẩn DNS
Ống nghiệm ĐC’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’
Dung dịch 1 (ml) 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Nước cất (ml) 10 9,9 9,7 9,5 9,3 9,1
Lấy 1 ml từ 7 ống nghiệm trên (dung dịch 2) cho vào 7 ống ủ mẫu
Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5
Dung dịch 2 (ml) 1 1 1 1 1 1
Thuốc thử DNS (ml) 3 3 3 3 3 3
Đậy nắp các ống nghiệm ĐC, 1, 2, 3, 4, 5 lại, đun cách thuỷ 5 phút, để nguội và đo ở bước sóng 540mm.
Từ kết quả OD, vẽ đồ thị đường chuẩn D – glucose.
Mẫu thí nghiệm: Pha loãng dịch Dx tỉ lệ n lần, lấy 1ml dịch đã pha loãng với 3 ml thuốc thử DNS đun cách thuỷ 5 phút, để nguội và đo ở bước sóng 540 mm. Chú
ý pha loãng sao cho kết quả OD của mẫu thí nghiệm nằm trong khoảng đường chuẩn D – glucose.
Kết quả
Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được X (mg/ml) đường khử trong dung dịch Dx pha lõang, nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc.
Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = X*n*V/m Trong đó:
X: lượng đường khử trong dung dịch Dx pha lõang (mg/ml).
V: thể tích dịch Dx (ml)
m: khối lượng mẫu ban đầu (g) n: hệ số pha loãng.
Nội dung 1: xác định thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ đầu tôm.
Để thuận tiện cho các tính toán về sau và xác định hiệu suất quá trình lên men, việc xác định các thành phần hoá học trong vỏ tôm là điều rất cần thiết.
Bảng 3.1. Thành phần hoá học của vỏ tôm
Thành phần Nguyên liệu vỏ tôm (%
khối lượng tươi)
Ẩm độ 77,43 ± 8,31
Khoáng 6,41 ± 0,22
N tổng số 4,07 ± 0,06
N amin (dịch trích ly) 0,037 ± 0,018 N protein (dịch trích ly) 0,059 ± 0,018
Theo Black và Schwartz (1950), chitin chứa 6,9 % là N trong thành phần, từ
các thành phần trên, có thể suy ra % khối lượng chitin trong mẫu.
Trong vỏ tôm, N tồn tại ở hai dạng: vô cơ và hữu cơ. Có thể nói, N vô cơ chủ
yếu trong vỏ tôm là N của chitin, vậy nên, N chitin = N tổng số – N hữu cơ.
Mặt khác, N hữu cơ trong vỏ tôm sau quá trình ly tâm có thể tính bằng công thức: N tổng trong dung dịch = N protein +N amin.
Từ đó, ta suy ra được % Chitin trong mẫu được tính bằng công thức:
% chitin = (% N tổng số – [% N protein + % N amin]) x 6,9 = 27,42 %
So với các nghiên cứu trước đây trên thế giới (trung bình 27%), %chitin trong bài báo cáo này không có thay đổi gì đáng kể.
3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus
Trong vỏ tôm tồn tại nhiều ion kim loại nhưng nhiều nhất là Ca2+ và Mg2+. Vì
vậy, quá trình khử khoáng trong vỏ tôm nhằm thu nhận chitin chủ yếu là loại bỏ hai ion này. Ca2+ và Mg2+ đều có khả năng tạo thành muối tan trong HCl và các acid hữu cơ như acid lactic.
Tỉ lệ nước rất quan trọng đối với quá trình lên men lactic vì nó ảnh hưởng trực tiếp tới lượng acid lactic sinh ra trong phản ứng. Trong quy trình lên men vỏ đầu tôm thu chitin, vấn đề này lại càng quan trọng hơn, vì lượng acid sinh ra ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình khử khoáng nhằm thu nhận chitin.
3.2.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ
lệ nước
Trong quá trình lên men, từ 24 giờ đầu tiên, kết quả đã cho thấy có sự lên men ở tất cả các tỉ lệ nước. pH của dịch lên men giảm từ 7 xuống còn khoảng 4 và giữ
nguyên ở các thời gian tiếp theo. Lượng acid sinh ra qua các thời gian có sự tăng lên rõ rệt.
Hình 3.1. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ nước sau các thời gian lên men.
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
24 48 72 96
% acid lactic
THỜI GIAN (GiỜ)
% Khối lượng acid lactic tổng hợp trong quá trình lên menvới các tỉ lệ nước:nguyên liệu
0,5 : 1 1 : 1 1,5 : 1 2 : 1 2,5 : 1
Theo kết quả ở hình 3.1, % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ đều có sự
khác biệt với sai khác có ý nghĩa thống kê với p – value ≤ 0,05. Ở tỉ lệ nước 2,5:1 v:w có thể cho thấy lượng acid lactic nhiều hơn hẳn so với các tỉ lệ nước khác và
các thời gian khác.
Tuy nhiên, ở các thời gian và tỉ lệ nước này, người làm đề tài chưa tìm ra được đỉnh của quá trình sinh acid lactic là tại thời điểm nào. Vì vậy, nên kéo dài thời gian lên men thêm để có thể xác định chính xác thời gian sinh mà quá trình lên men sinh acid lactic nhiều nhất.
3.2.2. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford.
Hình 3.2. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau.
Trong quá trình lên men lactic, L. acidophilus đã phân huỷ một phần protein trong dịch lên men thành N amin. Điều này lý giải cho việc hàm lượng N protein giảm dần qua các thời gian một cách rõ rệt.
Ở các tỉ lệ nước, tỉ lệ 2,5:1 v:w cho thấy hàm lượng N protein giảm rõ rệt nhất và khác biệt với các tỉ lệ nước khác với mức ý nghĩa thống kê p – value ≤ 0,05.
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00
0 24 48 72 96
HÀM LƯỢNG N-PROTEIN
(mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N-PROTEIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MENVỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚCKHÁC NHAU
0,5 : 1 1 : 1 1,5 : 1 2 : 1 2,5 : 1
3.2.3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước
Hàm lượng N - amin của có trong dịch sau các thời gian lên men được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.3. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau.
Qua các thời gian, lượng N - amin trong dịch lên men tăng lên đáng kể. Điều này cho thấy có sự phân giải protein trong vỏ tôm nguyên liệu thành các N - amin.
Sự sai khác giữa các thời gian lên men cũng như các tỉ lệ nước đều mang ý nghĩa thống kê với p –value ≤ 0,05 nhưng không khác biệt rõ ràng ở các tỉ lệ nước, cụ thể
là có sự tương đồng ở hai tỉ lệ 2,5:1 và 2:1 (v:w).
Nhìn vào đồ thị và số liệu, có thể thấy ở tỉ lệ nước 2,5:1 v:w và thời gian 96 giờ, hàm lượng N - amin đạt cực đại. Tuy nhiên, sự khác biệt về hàm lượng N - amin ở các tỉ lệ nước là không đáng kể cũng như chưa thất được đỉnh của quá trình phân giải protein. Người thực hiện đề tài nên kéo dài thời gian lên men để tìm ra thời gian thích hợp nhất cho quá trình này.
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50
0 24 48 72 96
HÀM LƯỢNG N-AMIN (mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N-AMIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MENVỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚCKHÁC NHAU
0,5 : 1 1 : 1 1,5 : 1 2 : 1 2,5 : 1
3.2.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men
Tổng N có trong dung dịch sau lên men tức tà N của protein thịt tôm được hòa tan vào dịch lên men lactic. Giá trị này bao gồm N - protein hòa tan, N - amin có
nguồn gốc từ protein thủy phân, nhưng giá trị này không bao gồm được phần N đã bị vi khuẩn đồng hóa. Do đó giá trị này được sử dụng để tham khảo, là bằng chứng của protein thịt tôm hòa tan vào dịch lên men có thể giảm nếu tốc độ đồng hóa của vi khuẩn cao hơn tốc độ hòa tan và thủy phân.
Hình 3.4. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau.
Dựa vào hình trên, ta có thể thấy ở tỉ lệ nước 2,5:1, hàm lượng tổng N không khác biệt nhiều khi so sánh giữa các tỉ lệ nước. Điều này hợp lý vì protein hòa tan từ
trong thịt đầu tôm vào nước có thể tồn tại dưới dạng protein hay dạng thủy phân của chúng.
Tóm lại, dựa vào các kết quả thu được ở nội dung nghiên cứu 2, người thực hiện đề tài đã lựa chọn tỉ lệ nước 2,5:1 v:w vì nhận thấy rằng ở tỉ lệ nước này, khả
năng sinh acid lactic là lớn nhất, các kết quả N - protein thấp hơn, N - amin cao hơn so với các tỉ lệ còn lại.
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
0 24 48 72 96
HÀM LƯỢNG Ntổng(mg/g)
THỜI GIAN (GiỜ)
HÀM LƯỢNG N TỔNG SỐ TRONG DUNG DỊCH(mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MENVỚI CÁC TỈ LỆ
NƯỚCKHÁC NHAU
0,5 : 1 1 : 1 1,5 : 1 2 : 1 2,5 : 1
Đồng thời, các khoảng thời gian lên men ở các thí nghiệm trên chưa cho biết được thời gian có lượng acid lactic là lớn nhất, người thực hiện đề tài đã kéo dài thời gian lên men lactic vỏ đầu tôm và tiến hành lấy mẫu khảo sát ở 48, 72, 96 và
120 giờ để tìm ra thời gian thích hợp nhất cho quá trình lên men.
3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus.
Đường là cơ chất chủ yếu của quá trình lên men lactic. Đề tài này sử dụng nguồn đường D – glucose vì đây là nguồn đường dễ sử dụng nhất cho VSV.
Việc xác định hàm lượng đường trong quá trình lên men rất quan trọng vì nó
sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới cá quá trình sinh tổng hợp của VSV. Nếu L. acidophilus đủ cơ chất để hoạt động, quá trình lên men sẽ đạt cực đại về lượng acid sinh ra, đồng thời các enzyme hoạt động cũng mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên, nếu chọn hàm lượng đường quá cao sẽ ức chế VSV phát triển, nếu quá thấp sẽ không đủ cơ chất cho VSV sống, cả hai vấn đề này đều ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá
trình lên men.
3.3.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ
lệ đường
Trong quá trình lên men, pH của dịch lên men luôn ở khoảng 4 đến 4,5. Tuy nhiên, ở mốc thời gian 120 giờ, pH đã tăng lên khoảng từ 4,8 đến 5. Điều này chứng tỏ đến thời gian này xuất hiện một quá trình khác đan xen, có thể là do hoạt động của các enzyme decarboxylase do vi khuẩn lactic sinh ra, làm xuất hiện các bioamine, dẫn đến tăng pH. Hiện tượng này cũng thừơng xuất hiện ở thực phẩm lên men. Để kéo dài thời gian lên men lactic và giữ pH ổn định lâu dài ở 4 - 4,5, cần tuyển chọn những chủng không có hoạt lực amino acid decarboxylase.