CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số PAs trong
3.1.1. Khảo sát điều kiện LC-MS/MS
Để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của các PAs trong nghiờn cứu, tiến hành tiờm dung dịch chuẩn hỗn hợp cú nồng độ 1 àg/mL vào khối phổ và thực hiện khảo sát ion mẹ, ion con. Hai ion con được lựa chọn cho mỗi chất, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, ion còn lại dùng để xác nhận. Các kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích PAs Tên chất
phân tích
Mảnh mẹ (m/z)
Mảnh con (m/z)
CE (eV) Ghi chú
Jacobine 352,3
120,1 22 Định lượng
155,2 20 Xác nhận
Echimidine 398,2
120,3 23 Định lượng
220,3 17 Xác nhận
Senecionine 336,2
120,2 27 Định lượng
138,2 29 Xác nhận
Intermidine 300,1
138,3 18 Định lượng
156,3 28 Xác nhận
Nhận xét: Qua khảo sát, điều kiện khối phổ hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của các PAs với ion mẹ có số khối là [M+H]+, mỗi chất đều thu được 2 ion con, phù hợp với quy định của châu Âu về số điểm IP.
Để tối ưu hóa điều kiện MS cho từng chất, nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật FIA, nghĩa là hỗn hợp chuẩn PAs cú nồng độ 1 àg/mL được bơm trực tiếp vào khối phổ cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký với điều kiện như sau: Pha động là (A) dung dịch HCOOH 0,1 % trong H2O và (B) ACN.
22
Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lượng và định tính của từng chất. Khảo sát các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion:
- ISV (IonSpray Voltage - Thế ion hóa) - TEM (Temperature - Nhiệt độ của nguồn) - GS1 (Ion Source Gas 1 - Khí nguồn ion 1) - GS2 (Ion Source Gas 2 - Khí nguồn ion 2) - CUR (Curtain Gas - Khí màng)
- CAD (Collisionally Activated Dissociation Gas - Khí va chạm ở Q2) Qua khảo sát ta thu được giá trị tối ưu của từng thông số trên cho cả các chất nghiên cứu. Các giá trị được liệt kê trong bảng 4.2.
Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS để phân tích các PAs Thông số Giá trị tối ưu
IS (V) 5000
TEM (oC) 400
GS1 (psi) 30
GS2 (psi) 30
CUR (psi) 25
CAD (psi) 7
Như vậy, các điều kiện khối phổ đã được lựa chọn xác định các PAs bằng MS/MS theo chế độ ion dương với nguồn ESI.
3.1.1.2. Khảo sát điều kiện LC
Pha tĩnh là C18 được ưu tiên lựa chọn do tính chất phổ biến rộng rãi và có một số nghiên cứu trước đây cũng sử dụng các loại cột có bản chất pha tĩnh này. Tuy nhiên, kết quả khảo sát cho thấy pic sắc ký của Intermedine và Jacobine lưu giữ rất kém, thời gian lưu tương ứng là 2 phút và 2,6 phút. Hơn nữa, pic sắc ký của Intermedine bị doãng và chẻ ngọn.
Sắc ký đồ của Intermidine và Jacobine khi phân tích bằng hai loại cột sắc ký được đưa ra ở hình 3.1.
Để tăng hiệu quả tách, nhóm nghiên cứu đã khảo sát cột TSK Gel với bản chất pha tĩnh là hạt Amide-80 có độ phân cực hơn so với cột C18.
23
Hình 3.1. Sắc đồ Ichimidine và Jacobine sử dụng cột C18 và cột TSK Gel Nhận xét: PAs là các chất tương đối phân cực, khó tương tác với pha tĩnh không phân cực của cột C18 nên không lưu giữ được chất phân tích. Khi sử dụng cột TSK Gel pic sắc ký thu được rất nhọn, sắc nét, thời gian lưu khoảng 5 phút với mỗi PAs, do đó cột TSK Gel đã được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Gradient rửa giải là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình tách các PAs. Do sử dụng cột TSK Gel phân cực nên chương trình gradient đã được khảo sát. Qua khảo sát đã lựa chọn được chương trình gradient để rửa
Intermedine TSKgel
Intermedine C18
Jacobine TSKgel
Jacobine C18
24
giải các PAs (bảng 3.3). Sắc ký đồ phân tích hỗn hợp chuẩn PAs được trình bày ở hình 3.2 và 3.3.
Bảng 3.3. Điều kiện gradient Thời gian
(phút)
Kênh A
(HCOOH 0,1%/ H2O)
Kênh B (ACN)
0,01 10 90
2,5 10 90
2,55 90 10
5,5 90 10
5,55 10 90
8,0 10 90
Hình 3.2. Sắc đồ tổng các PAs
25
Hình 3.3. Sắc đồ MRM của từng PAs
Nhận xét: Sử dụng cột TSk Gel kết hợp với gradient đã khảo sát ở trên để phân tích đồng thời 4 PAs cho thấy các pic thu được nhọn, sắc nét, có thể định lượng từng chất riêng biệt do khối phổ của các chất phân biệt rõ ràng. Mỗi chất đều có 2 ion con được sử dụng để định lượng và xác nhận.
Echimidine Jacobine Senecionine
Intermidine
26