CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Một số phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Xác định số lượng tế bào theo kỹ thuật đổ đĩa.
Nguyên tắc:
Tế bào sống được xác định như một tế bào có khả năng phân chia, sinh sản. Cách thường dùng để tính số tế bào sống là xác định số tế bào trong mẫu có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch thích hợp.
Cách tiến hành:
Pha loãng mẫu : Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý và một số đầu tuýp (1ml) vô trùng. Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân như ở hình 2.2:
Hình 2.2 : Pha loãng theo dãy số thập phân
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 26 Ống nuôi cấy
ban đầu(ống gốc)
Pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Độ pha loãng 101 102 103 104 105
1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis
Xây dựng môi trường nuôi cấy
- Thời gian tạo sinh khối.
- Nồng độ tế bào.
- Hiệu suất tạo bào tử.
Thu sinh khối
Lên men trong môi trường lỏng Khảo sát ảnh hưởng của thời gian.
Đánh giá chất lượng sinh khối
Muốn xác định khuẩn lạc ở độ pha loãng nào thì hút 1ml ở độ pha loãng đó vào đĩa Petri và đổ môi trường vào đĩa. Sau đó, xoay đều theo chiều kim đồng hồ và xoay ngược lại. Mỗi độ pha loãng được lặp lại hai lần. Khi môi trường đông lại lật úp các đĩa và đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ phòng 300C.
2.5.2. Xác định nồng độ tế bào theo phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc:
Số lượng sinh khối trong mẫu đem đo phải tỉ lệ với lượng photon ánh sáng bị phân tán.
Đồng thời, hình dạng tế bào phải đồng nhất, và dung dịch phải trong suốt, không có cặn hay lơ lửng trong dung dịch mẫu đem đo.
Cách tiến hành:
Cấy chủng Bacillus subtilis vào trong 100ml môi trường lỏng TCS. Đem nuôi trên máy lắc trong vòng 24h và ở nhiệt độ 300C. Tiếp đó, chuyển 10% giống vừa nuôi 24h vào bình 250ml chứa sẵn 100ml môi trường tương ứng, tiếp tục nuôi trên máy lắc ở 300C, trong 24h. Tốc độ lắc là 120v/ph.
Sau khi đã được 24h nuôi cấy hút một ít mẫu cho vào cuvette và đo độ hấp thu ở bước sóng 600nm trên máy đo OD.
2.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis
Phương pháp: Nghiên cứu này được thực hiện theo phương pháp đo độ hấp thu quang [2.5.1] và phương pháp đổ đĩa [2.5.2].
Cách tiến hành:
Chuyển 10% giống được nuôi trước đó 24h cho vào bình tam giác 250ml có chứa sẵn 100ml môi trường lỏng TCS. Sau đó, đem nuôi trên máy lắc với các nhiệt độ khác nhau từ 300C, 350C, 400C, 450C, 500C với tốc độ lắc của máy là 120v/ph. Sau 24h đem đo độ hấp thu quang và xác định số lượng tế bào.
2.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 27
Độ hấp thu quang đo được = giá trị của mẫu đo – giá trị mẫu đối chứng
Phương pháp: Nghiên cứu về ảnh hưởng của pH được thực hiện theo các phương pháp xác định số lượng tế bào bằng kỹ thuật đổ đĩa [theo mục 2.5.1] và phương pháp đo mật độ quang [theo mục 2.5.2].
Cách tiến hành:
Chuyển 10% giống ở bình nuôi trước 24h cho vào bình tam giác 250ml có chứa sẵn 100ml môi trường lỏng TCS. Sau đó, đem chỉnh pH với các pH khác nhau 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.1, 7.5, 8.0, 8.5 và nuôi trên máy lắc với tốc độ lắc của máy là 120v/ph. Sau 24h đem đo độ hấp thu quang và xác định số lượng tế bào.
2.5.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis
Phương pháp: Phương pháp đo mật độ quang [ theo mục 2.5.2] và xác định tế bào khuẩn lạc bằng kỹ thuật đổ đĩa [theo mục 2.5.1] là hai phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị bình giống ở nhiệt độ tối ưu là 300C và pH tối ưu pH = 6,0. Cấy 10% giống đã nuôi ở 24h cho vào bình tam giác 250ml có chứa sẵn 100ml môi trường lỏng TCS với các nguồn cacbon khảo sát là: rỉ đường, tinh bột, glucose, succarose, bột mì. Trước khi cấy chủng cần chỉnh các môi trường về pH = 6 và đem thanh trùng ở chế độ 1210C, trong 15 phút. Sau đó, nuôi trên máy lắc với chế độ nuôi là 120v/phút, nhiệt độ 300C, thời gian 24h. Sau 24h đem đo mật độ quang và xác định số lượng tế bào ở nguồn cacbon có độ hấp thu cao nhất bằng phương pháp đổ đĩa thạch.
2.5.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis
Phương pháp: Nghiên cứu này được thực hiện theo các phương pháp của mục 2.5.1 và 2.5.2.
Cách tiến hành:
Chuyển 10% sinh khối Bacillus subtilis của bình nhân giống cấp 1 vào môi trường lỏng TCS với nguồn Nitơ được khảo sát là: pepton, bã đậu nành, casein, KNO3, NaNO3, Urê.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 28
Trước khi cấy chủng cần chỉnh các môi trường về pH = 6 và thanh trùng ở chế độ 1210C, trong 15 phút. Đem nuôi trên máy lắc ở nhiệt độ 300C, 120v/phút, trong 24h. Sau 24h đem đo mật độ quang và xác định số lượng tế bào khuẩn lạc ở nguồn nitơ có độ hấp thu cao nhất bằng phương pháp đổ đĩa thạch.
2.5.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis
Phương pháp: Được thực hiện theo các phương pháp ở mục 2.5.1 và 2.5.2.
Cách tiến hành:
Chuyển 10% giống được nuôi trước 24h vào bình tam giác chứa sẵn 100ml môi trường TCS với các nồng độ muối khảo sát lần lượt là :1%, 2%, 3%, 5%. Điều chỉnh môi trường về pH = 6 và thanh trùng ở chế độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, nuôi giống trong 24h trên máy lắc với tốc độ lắc của máy là 120v/ph, t = 300C. Sau 24h nuôi đem đo độ hấp thu quang và xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đổ đĩa.
2.5.8. Nghiên cứu xây dựng môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus subtilis Phương pháp: Được thực hiện bởi hai phương pháp được nêu ở mục 2.5.1 và 2.5.2.
Cách tiến hành:
Môi trường thay thế được chuẩn bị đầy đủ để nuôi cấy chủng Bacillus subtilis ( cho ở bảng 3.1) với các điều kiện tối ưu như t = 300C, pH 6,0. Đem thanh trùng môi trường trước khi cấy giống VSV. Chuyển 10% giống vào môi trường thay thế, sau đó nuôi trên máy lắc ở nhiệt độ 300C; pH 6,0. Sau 24h đo độ hấp thu quang và xác định số lượng tế bào bằng kỹ thuật đổ đĩa.
2.5.9. Nghiên cứu khả năng tạo bào tử của chủng Bacillus subtilis
Phương pháp: Nghiên cứu được thực hiện theo các phương pháp của mục 2.5.1 và 2.5.2.
Cách tiến hành:
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 29
- Bổ sung 0.01% MnCl2.4H2O vào bình 250ml chứa sẵn giống đã nuôi trước 24h. Sau đó đem nuôi tiếp trên máy lắc trong 3 ngày liên tục ở chế độ 300C, tốc độ quay là 120v/ph. Sau mỗi 24h đem đo độ hấp thu quang và tiến hành xác định khuẩn lạc. Trong ngày cuối cùng chuyển 5ml mẫu vào hai ống nghiệm khác nhau. Một ống nghiệm đem đi xác định khuẩn lạc và một ống còn lại đem xử lý nhiệt ở 800C, trong 10 phút trước khi xác định khuẩn lạc.
2.5.10. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến tốc độ sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis
Phương pháp: Dùng hai phương pháp được nêu ở mục 2.5.1 và mục 2.5.2.
Cách tiến hành:
Chuyển 10% giống cấp 1 lên 4 lít môi trường lỏng chứa sẵn trong thiết bị lên men và môi trường đã được thanh trùng ở chế độ 1210C trong 15 phút. Nuôi cấy chủng này trong 3 ngày liên tiếp. Sau các điểm thời gian 0h, 24h, 36h, 48h và 72h đo độ hấp thu quang và xác định nồng độ tế bào.
SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 30