Ngoài các phương pháp vật lý và hóa học, hiện nay các phương pháp sinh học đang đư c quan tâm. Chế ạo bằợ t ng phương pháp sinh h c nghĩa là ch ạo vật ọ ế t liệu Nano bằng cách sử ụ d ng các v t liậ ệu sinh học hoặc các kỹ thuật sinh học như:
t lự ắp ráp phân tử, vi ch tác d a trên khuôn sinh học, phỏế ự ng sinh học, sinh học phân tử...
T lự ắp ráp phân tử là m t cách tiếộ p cận tuyệt vờ ểi đ chế ạ t o các c u trúc siêu ấ phân tử. Có thể chế ạ t o sợi nano từ các peptit ion hóa t l p ráp bổ sung trong dung ự ắ dịch lỏng hay tạo ra các dây ano bằng cách sử ụng bộ khung sinh học. Nếu nhúng n d peptit tự ắ l p ráp vào dung dịch muối hoặc môi trường sinh lý thì có thể ạ t o ra bộ khung sợi nano peptit và protein. Nhờ các khuôn sinh học có thể ch t o tấm hoặc ế ạ các dây Nano dẫn đi n lắệ p ráp trên khuôn DNA. Đã có nh ng công trình nghiên cứu ữ các virus có khả năng kết tinh các h t tinh thạ ể nano ZnS hoặc CdS.
Trong lĩnh vực ph ng sinh họỏ c phân t , ngư i ta có th t o ra các v t li u ử ờ ể ạ ậ ệ Nano nhờ ử ụ s d ng các tính chất nhận biết và gắn kết của protein với các chất vô cơ.
Tuy nhiên chỉ ộ m t vài polypeptit đư c xợ ác định là gắn đặc hiệu với các chất vô cơ.
Chúng hầu hết là các protein khoáng hóa sinh h c ti t ra tọ ế ừ mô r n sau khi đã đư c ắ ợ phân tách, tinh ch và tách dòng.ế
1 5.1. . Ứng dụng
Việc nghiên cứu ứng dụng các hạt nano siêu thuận từ đang được tiến hành rất rộng rãi, đặc biệt là ứng dụng trong y sinh học và môi trường. Công nghệ nano đang thay làm thay đổi cuộc sống của chúng ta nhờ vào khả năng can thiệp của con người tại kích thước nano mét, tại đó vật liệu nano thể hiện rất nhiều tính chất đặc biệt và lý thú . Các cấu trúc nano có tiềm năng và khả năng ứng dụng rất cao trong rất nhiều lĩnh vực của đời sống như y sinh học, hóa chất, vật liệu, môi trường, công nghệ thông tin, viễn thông, năng lượng, tự động hóa, hàng không, vũ trụ…
+ Y sinh học : Hạt nano.
+ Hóa chất và vật liệu cao cấp : Ống nano.
+ Môi trường : Xử lý nước
+ Công nghệ thông tin, viễn thông : Vật liệu xốp nano.
+ Năng lượng : Lồng nano.
+ Tự động hóa : Chấm lượng tử.
+ Hàng không vũ trụ : Vật liệu cấu trúc nano.
+ Dệt : Sợi nano.
+ Nông nghiệp : Hạt chứa hạt nano (capsule).
1 5.1. .1. Ứng dụng để xử lý môi trường
Ngày nay, ô nhiễm do kim loại nặng thải ra từ các ngành công nghiệp là một mối đe d a nghiêm trọọ ng đ i với sức khoẻ con người và sự an toàn của hệ sinh thái. ố Việc lo i tr các thành ph n ch a kim loạ ừ ầ ứ ại nặng độc ra kh i các nguỏ ồn nư c, đ c ớ ặ biệt là nư c thải công nghiớ ệp là mục tiêu môi trường quan trọng bậc nh t ph i giấ ả ải quyết hiện nay. Việc kết h p oxit sợ ắt từ và chitosan với nhau đã phát huy được những ưu điềm của từng chất, t o ra v t liạ ậ ệu có ả năng hấp phụkh các kim lo i nặng ạ chẳng hạn như Cu2+ , Ni2+ và Co2+[33], đặc biệt là những ưu đi m như dể ễ thu h i, ồ có thể ử ụ s d ng đư c nhiều lầợ n. Đây là m t bưộ ớc c i tiả ến về ặ m t công nghệ đem l i ạ hiệu quả kinh tế cao.
Ví dụ : A sen (III) và asen (V). Đ loại bỏ ể asen có nhiều cách trong đó có thể s dử ụng hạt nano oxit sắt từ để ấ h p phụ asen, loại chúng ra khỏi nước. B ng thực ằ
nghiệm cho thấy khi cho hạt nano oxit sắ ừ ớt t v i n ng đ 1g/l vào m u nư c có ồ ộ ẫ ớ chứa nồng đ asen là 0.1mg/l chộ ỉ sau một phút thì nồng đ asen đã giảm chỉ còn ộ 0.0081mg/l dưới tiêu chu n củẩ a B y t cho phép n ng đ asenic t i đa là 0.01 mg/l ộ ế ồ ộ ố đây là điều chúng ta mong muốn.
1 5. .1. 2. Ứng dụng làm vật liệu y sinh
Một nhánh quan trọng của công nghệ nano, đó là sinh học nano, trong đó, y vật liệu nano được sử dụng để chẩn đoán và điều trị bệnh. Y sinh học nano đã và đang được nghiên cứu rất mạnh mẽ nhờ vào khả năng ứng dụng rất linh hoạt và hiệu quả của vật liệu nano [8,19].
Trong lĩnh vực y sinh học thì các hạt nano siêu thuận từ Fe3O4 được sử dụng nhiều hơn cả vì đây là một vật liệu dễ chế tạo, từ tính mạnh (từ độ bão hoà có thể đạt tới 90 emu/g), tương đối bền trong môi trường cơ thể và quan trọng hơn là có tính tương hợp sinh học nghĩa là không độc đối với cơ thể sinh vật. Đây là thị trường lớn nhất tiêu thụ vật liệu nano, các ứng dụng hạt nano để dẫn truyền thuốc đến một vị trí nào đó trên cơ thể là một trong những ví dụ về ứng dụng của hạt nano. Trong ứng dụng này, thuốc được liên kết với hạt nano có tính chất từ, bằng cách điều khiển từ trường để hạt nano cố định ở một vị trí trong một thời gian đủ dài để thuốc có thể khuyếch tán vào các cơ quan mong muốn.
Vật liệu nano có khả năng ứng dụng trong sinh học vì kích thư c cớ ủa nano so sánh được v i kích thư c c a t ớ ớ ủ ếbào (10 100 nm), virus (20 450 nm), protein (5 50 - - - nm), gen (2nm rộng và 10-100nm chiều dài)[12]. Với kích thước nh bé cỏ ộng với việc “ng y trang” giụ ống như các thực thể sinh học khác và có th thâm nhể ập vào các tế bào ho c virặ us.
Chính vì thế mà hạt nano có thể thâm nhập vào hầu hết các cơ quan trong cơ thể và giúp cho chúng ta có thể thao tác ở qui mô phân tử và tế bào [20]. Từ trường không có hại đối với con người nên các hạt nano từ tính được quan tâm sử dụng rất nhiều vào mục đích chẩn đoán và chữa bệnh.
Các ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể và trong cơ thể. Chúng tôi chỉ trình bày một số ứng dụng tiêu biểu trong rất nhiều
ứng dụng đã và đang được nghiên cứu. Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác. Các ứng dụng trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, đốt nóng cục bộ và tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ [2, 6, 19].
a. Phân tách và ch n lọ ọ ếc t bào
Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác. Phân tách tế bào sử dụng các hạt nano từ tính là một trong những phương pháp thường được sử dụng.
Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn:
- Đánh dấu thực thế sinh học cần nghiên cứu
- Tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường
Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ tính. Hạt nano thường dùng là hạt oxit sắt. Các hạt này được bao phủ bề mặt màng có tính tương hợp sinh học như là dextran, polyvinyl alcohol (PVA),... Màng bao phủ được chức năng hóa để có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử và còn giúp cho các hạt nano phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ. Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hormone, acid folic tìm thấy.
Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [18]. Đối với các tế bào lớn, kích thước của các hạt từ tính đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nano mét.
Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài. Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu. Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài. Lực tác động lên hạt từ tính được cho bởi phương trình sau:
F = 6 pi n R Dn (1.11)
Trong đó n là độ nhớt của môi trường xung quanh tế bào (nước), R là bán kính của hạt từ tính, Dn là sự khác biệt về vận tốc giữa tế bào và nước.
Sơ đồ phân tách tế bào đơn giản nhất được trình bày ở hình 1.8
Hình 1.8: Sơ đồphân tách tế bào
Hỗn hợp tế bào và chất đánh dấu (hạt từ tính bao phủ bởi một lớp chất hoạt hóa bề mặt) được trộn với nhau để các lên kết hóa học giữa chất đánh dấu và tế bào xảy ra. Sử dụng một từ trường ngoài là một thanh nam châm vĩnh cửu để tạo ra một gradient từ trường giữ các hạt tế bào được đánh dấu lại.
b. Dẫn truyền thuốc
Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu đó là tính không đặc hiệu. Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tập trung nên các tế bào mạnh khỏe bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc. Chính vì thế việc dùng các hạt từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970, những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính.
Phương pháp này có hai lợi ích cơ bản là:
- Thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc.
- Giảm lượng thuốc điều trị.
Hạt nano từ tính có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị.
Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang. Thông thường hệ thuốc/hạt tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn. Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào
một vị trí nào đó trên cơ thể. Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ. Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào. Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt.
Hiệu quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường, thể tích và tính chất từ của hạt nano.
Nguồn từ trường thường là nam châm NdFeB có thể tạo ra một từ trường khoảng 0,2 T và gradient từ trường khoảng 8 T/m với động mạch đùi và khoảng 100 T/m với động mạch cổ. Điều này cho thấy quá trình dẫn thuốc bằng hạt nano từ tính có hiệu quả ở những vùng máu chảy chậm và gần nguồn từ trường. Tuy nhiên, khi các hạt nano chuyển động ở gần thành mạch máu thì chuyển động của chúng không tuân theo định luật Stoke nên với một gradient từ trường nhỏ hơn quá trình dẫn thuốc vẫn có tác dụng.
Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã được thử nghiệm rất thành công trên động vật, đặc biệt nhất là dùng để điều trị u não. Việc dẫn truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vượt qua hàng rào ngăn cách giữa não và máu, nhờ có trợ giúp của hạt nano từ có kích thước 10-20 nm, việc dẫn truyền thuốc có hiệu quả hơn rất nhiều. Việc áp dụng phương pháp này đối với người tuy đã có một số thành công, nhưng còn rất khiêm tốn [8 ].
c. Tăng thân nhiệt cục bộ
Phương pháp tăng thân nhiệt cục bộ các tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường là một trong những ứng dụng quan trọng khác của hạt nano từ tính. Nguyên tắc hoạt động là các hạt nano từ tính có kích thước từ 20-100 nm được phân tán trong các mô mong muốn sau đó tác dụng một từ trường xoay , chiều bên ngoài đủ lớn về cường độ và tần số để làm cho các hạt nano hưởng ứng mà tạo ra nhiệt nung nóng những vùng xung quanh. Nhiệt độ khoảng 42°C trong khoảng 30 phút có thể đủ để giết chết các tế bào ung thư. Nghiên cứu về kĩ thuật
tăng thân nhiệt cục bộ được phát triển từ rất lâu và có rất nhiều công trình đề cập đến kĩ thuật này nhưng chưa có công bố nào thành công trên người. Khó khăn chủ yếu đó là việc dẫn truyền lượng hạt nano phù hợp để tạo ra đủ nhiệt lượng khi có sự có mặt của từ trường ngoài mạnh trong phạm vi điều trị cho phép. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nung nóng cục bộ là lưu lượng máu và phân bố của các mô.
1 . Gi.2 ới thiệu vềChitosan
1.2.1. Nguồn gốc Chitosan (CS).
CS được xem là polymer nguồn gốc ự nhiên quan trọt ng nh t, là d n xu t ấ ẫ ấ của chitin. Vớ ặi đ c tính tương thích sinh học và có thể hoà tan tốt trong môi trư ng ờ acid, chitosan được ứng d ng trong nhiềụ u lĩnh v c (như th c phẩm, mỹự ự ph m, dư c ẩ ợ phẩm …)
Trong mỗi lo i ạ nguyên liệu ta thu được nh ng d n xuấữ ẫ t khác nhau. B ng ằ phương pháp nhiễu x tia X, ngư i ta đã ch ng minh đư c chitin có ch y u trong ạ ờ ứ ợ ủ ế v cỏ ứng của các loài đ ng vậộ t giáp xác như: tôm, cua, mai m c…[4, 5, 30] vì vậy ự trong s các polyme nguố ồn gố ự c t nhiên sản lư ng của chitin rấ ớn. ợ t l
1.2.2. Cấu trúc và tính chất của C [S 4, 28 ]
CS là dẫn xuất đ ề axetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở ị trí C(2). CS được cấu t o t v ạ ừ các m t xích D glucozamin liên ắ - kết với nhau bởi các liên kết b (1 4) glicozit, do vậy CS có thể ọi là Poly β (1 4)- - - g - - - - 2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly β (1 4)- - - -D- glucozamin (cấu trúc III).
Hình 1.9: Cấu trúc hitosanC
Bằng phổ ộ c ng hư ng từ ạt nhân(NMR), phổ ồng ngoại(IR) và một sốở h h phương pháp khác đã xác đ nh đưị ợc c u trúc hoá h c c a CS r t gi ng Xenlulo. ấ ọ ủ ấ ố Trong Xenlulo nhóm -OH ở ị trí C v 2 của mỗi đơn vị D-Glucoza. Khi thay nhóm – OH trong Xenlulozo bằng nhóm -NH2ta được cấu trúc của CS.
Khi deaxetyl hoá chitin (CT) trong môi trường kiềm đ c đ biếặ ể n đ i nhóm ổ amit thành nhóm amin thu được CS:
{-CH2OH, OH,- -NHCOCH3}→{-CH2OH, OH,- -NH2}
Phản ứng trên trong th c t x y ra không hoàn toàn vì vậự ế ả y ngư i ta quy ước : ờ - Độ deaxetyl hoá (degree of deactylation): (DD) 50% gọi là CS. >
DD ≤ 50% gọ là CT.i
CS được Rouget phát hiện lần đ u tiên vào năm 1859, khi ông đun sôi CT ầ trong dung dịch KOH đặc. Do CS có nhóm amin nên tính chấ ủt c a nó khác r t nhiều ấ CT. CS tan được trong axít loãng, đây cũng chính là đ c điặ ểm d nhễ ất để phân bi t ệ CS và CT.
1.2.2.1.Tính chấ ật v t lý c a ủ CT/CS [28, 29].
Các nghiên cứu về ạ tr ng thái, màu sắc, mùi vị, tính tan của chitin/chitosan (CT/CS) trong nước và trong một vài dung môi khác như: axit, bazơ hoặc trong các dung môi hữu cơ thấy r ng: CS th r n t n t i dư i hai d ng: d ng tinh th và ằ ở ể ắ ồ ạ ớ ạ ạ ể dạng vô đ nh hình; Không tan trong nư c, kiềị ớ m đ c và loãng, không tan trong cồn, ặ axeton và các dung môi hữu cơ khác; CS tan trong dung dich axit loãng t o dung ạ dịch keo trong suốt; Đ nh t củộ ớ a CS trong dung dịch keo liên quan đến kích thước và khối lượng phân t trung bình cử ủa CS (đây cũng là tính chất chung của tất cả dung dịch polyme).
1.2.2.2. Tính chất hoá học của CT/CS [29].
Trong phân tử CT/CS có ch a các nhóm chức -ứ OH, NHCOCH- 3 trong các mắt xích N axetyl- -D-glucozamin và nhóm OH, nhóm NH- - 2 trong các mắt xích D- glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol v a là amin, v a là amit. Ph n ng hoá học ừ ừ ả ứ có thể ả x y ra ở ị v trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O- ẫn xuấ, d t thế N-, hoặc dẫn xuất th O-ế , N.
Mặt khác CT/CS là những pol me mà các monome được nối với nhau bởi y r các liên kết (1β- - -4) glicozit; các liên kết này rất dễ ị ắ ứ b c t đ t b i các ch t hoá hở ấ ọc như: axit, bazơ, tác nhân oxy-hóa và các enzim thuỷ phân
a. Các phản ứng của nhóm OH- - Dẫn xuất sunfat.
- Dẫn xuất O axyl hóa CT/CS.- - Dẫn xuất O tosyl hoá CT/Cs. - b. Phản ứng ở ị v trí N.
- Phản ứng N axetyl hoá CS.- - Dẫn xuất N sunfat hóa CS.-
- Dẫn xuất N glycochitosan (N-hidrroxy-- etylchitosan).
- Dẫn xuất acroleylen CS.
- Dẫn xuất acroleyl CS
c. Phản ứng xảy ra tại vịtrí O, N.
- Dẫn xuất O,N cacboxymetyl CS.- - Dẫn xuất N,O cacboxy CS.-
- Phản ứng cắ ứt đ t liên kết (1 4) glicozit.-
1.2.2.3. Khả năng hấp phụ ạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp của t chitin/chitosan
Trong phân tử CT/CS và m t số ẫộ d n xuất c a chitin có c a các nhóm chủ hứ ức mà trong đó các nguyên t Oxi và Nitơ cử ủa nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có kh năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và ả các kim lo i chuy n tiạ ể ếp như: Hg2+, Cd2+, Cr6+ , Zn2+, Cu2+,Ni2+,Co2+...[33, 34, 35]. Tuỳ nhóm chức trên mạch polime mà thành phần và cấu trúc c a phứủ c khác nhau.
Ví d : vụ ới phức Ni2+ với chitin có cấu trúc bát diện với số phối trí bằng 6, còn phức Ni2+ với chitosan có cấu trúc tứ diện với số phối trí bằng 4.