6.1. Giới thiệu về đối tượng phân tích
Viên nang Artemisinin 250 mg được phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.), họ Asteriaceae, được dùng để điều trị bệnh sốt rét do Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax, có hiệu lực cả với sốt rét do P.falciparum đa kháng. Khác với các thuốc chống sốt rét hiện đang dùng có cấu trúc dị vòng chứa nitơ, artemisinin là một sesquiterpen lacton có cầu nối endoperoxid. Cầu nối này rất quan trọng đối với tác dụng chống sốt rét của thuốc. Artemisinin có tác dụng mạnh diệt thể phân liệt, nhưng thực tế không có tác dụng trên thể ngoại hồng cầu, thể thoa trùng và thể giao tử.
Cơ chế tác dụng của artemisinin còn chưa biết thật rõ. Thuốc tập trung chọn lọc vào tế bào nhiễm ký sinh trùng và phản ứng với hemin (hemozoin) trong ký sinh trùng.
In vitro, phản ứng này hình như sinh ra các gốc hữu cơ tự do độc hại có thể phá hủy các màng của ký sinh trùng.
Trong bài thực tập này, sinh viên sẽ tiến hành xác định hàm lượng artemisinin trong viên nén artemisinin 250 mg, thành phần tá dược gồm Tinh bột, Magnesi stearat, Talcum (vừa đủ 1 viên) của công ty Cổ phần Dược phẩm Trung ương 2 ( Dopharma) hoặc Công ty cổ phần hóa - Dược phẩm Mekophar hoặc của hãng khác tương đương.
6.2. Nguyên tắc phân tích
Artemisinin có công thức phân tử C15H22O5 , cấu tạo như sau:
Artemisinin là chất bột trắng trong suốt không màu, không tan trong nước, nhưng tan trong axeton, etyl axetat; metanol, ethanol và kiềm.
Trong phân tử artemisinin do có hệ electron ở liên kết C=O và cặp đôi electron chưa liên kết trên nguyên tử O mà phân tử này trong môi trường kiềm có phổ hấp thụ vùng UV. Cực đại hấp thụ đạt được ở max = 290 nm.
Bằng cách đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn Artemisinin trong môi trường kiềm ở các nồng độ khác nhau của dung dịch chuẩn và biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ artemisinin từ đó có thể xác định được hàm lượng artemisinin theo phương pháp đường chuẩn.
6.3. Hóa chất, thuốc thử và mẫu phân tích
6.3.1. Hóa chất, dụng cụ do phòng thí nghiệm chuẩn bị
Chất chuẩn Artemisinin (tinh thể màu trắng).
Etanol 96%.
Dung dịch chuẩn gốc Artemisinin 500 ppm: Cân 0,2500 g Artemisinin, chuyển vào bình định mức 500 mL, định mức đến vạch bằng etanol 96%.
Dung dịch NaOH 0,05M.
Bể điều nhiệt; Bể rung siêu âm.
Dụng cụ cho mỗi nhóm gồm 5 sinh viên:
- 08 bình định mức 25 mL - 01 pipet chia vạch 5 mL.
- Chày và cối sứ để nghiền mẫu.
- 02 cốc thủy tinh 100 mL để phá mẫu.
- Đũa thủy tinh, phễu thủy tinh.
- 02 bình định mức 100 mL.
- 02 bình định mức 50 mL (khô).
- 01 pipet 10 mL.
6.3.2. Hóa chất và mẫu do sinh viên chuẩn bị
(sinh viên làm thí nghiệm theo nhóm, mỗi nhóm 5 sinh viên)
Viên nén Artemisinin 250 mg (CTCPDPTW II) : mỗi nhóm 5 sinh viên cần 5 viên thuốc.
Lấy 5 viên thuốc, cân chính xác khối lượng của cả 5 viên. Nghiền nhỏ cả 5 viên thuốc trong cối sứ, loại bỏ vỏ. Cân trên cân phân tích khối lượng tương ứng 1 viên, chuyển ẫu vào cốc chịu nhiệt 100 ml, thêm vào mẫu 60 mL dung dịch NaOH 0,05 M, rung siêu âm trong 10 phút, điều nhiệt 500C trong 30 phút.
Chuyển toàn bộ dịch chiết (gồm cả bã rắn) vào bình định mức 100 mL, tráng rửa cốc và định mức đến vạch bằng dung dịch NaOH.
Chờ dung dịch trong bình lắng, lọc gạn dung dịch qua giấy lọc băng trắng vào một bình định mức 50 mL được dung dịch A. Chú ý: phễu thủy tinh, giấy lọc và bình định mức 50 mL đều phải khô, không định mức dung dịch này.
6.4. Qui trình phân tích 6.4.1. Xây dựng đường chuẩn
- Sinh viên tự tính toán để lấy các thể tích xác định của dung dịch chuẩn gốc artermisinin vào 7 cốc dung tích 100 ml sao cho nồng độ cuối của artermisinin sau khi chuyển vào trong bình định mức 25 ml trong khoảng 2- 25 ppm. Thêm 15 ml dung dịch NaOH 0,05 M vào mỗi cốc.
Đặt 5 cốc này vào máy điều nhiệt ở nhiệt độ 500C trong 30 phút. Sau đó ngâm các cốc vào chậu nước, làm nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển định lượng các dung dịch này vào bình định mức tương ứng, định mức đến vạch mức bằng dung dịch NaOH 0,05 M, lắc đều.
- Tìm bước sóng cực đại của artermisinin trong vùng UV.
Dùng dung dịch chuẩn thứ hai để quét phổ hấp thụ của artermisinin với dung dịch mẫu trắng (cốc số 8) (chuẩn bị tương tự như trên nhưng không có chất phân tích) trong khoảng 250nm đến 400nm và tìm bước sóng cực đại.
- Đo độ hấp thụ quang của 7 dung dịch chuẩn ở ở bước sóng cực đại của artermisinin và tìm phương trình biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn với nồng độ artemisinin (ppm).
6.4.2. Phân tích mẫu thuốc theo phương pháp đường chuẩn
Dùng pipet lấy 5,00 ml dung dịch A vào bình định mức 25 ml, đinh mức đến vạch mức bằng dung dịch NaOH 0,05 M. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch này ở bước sóng cực đại của artemisinin với dung dịch so sánh là mẫu trắng ở trên.
Dựa vào đường chuẩn tìm nồng độ artemisinin trong mẫu thuốc ban đầu.