Phần 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Đánh giá hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh với nấm gây bệnh
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh được mô tả theo Živković và cộng sự (2010) [43]. Tổng số VKNS được cấy vệt trên môi trường thạch PDA, khoảng cách vệt cấy xấp xỉ 1cm với mép đĩa petri. Nấm gây bệnh được cắt khoảng 1cm2 và đặt đối diện với vệt cấy VKNS. Các mẫu thử nghiệm được ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3 - 5 ngày. Tỷ lệ phần trăm sự ức chế tăng trưởng xuyên tâm (RI%) được tính như sau:
RI (%) =
D1: Sự tăng trưởng xuyên tâm của nấm gây bệnh
D2: Sự tăng trưởng xuyên tâm của nấm gây bệnh đối với VKNS đối kháng.
Tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng xuyên tâm được phân loại từ khả năng chống nấm từ thấp đến rất cao, được đánh giá như sau:
• 30% = hoạt động kháng nấm thấp
• 30 - 50% = hoạt động kháng nấm vừa phải
• 50 - 70% = hoạt tính kháng nấm cao
• ≥70% = hoạt động kháng nấm rất cao
Những VKNS có kết quả tỷ lệ kháng nấm gây bệnh lớn hơn 30% được lựa chọn và lưu giữ để nghiên cứu tiếp.
3.3.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào
Phương pháp cấy chấm điểm trên thạch: Dùng que cấy lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng, sau đó cấy chấm một điểm vào môi trường có chứa 1% cơ chất tương ứng. Sau đó ủ tại nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng; đo đường kính vòng phân giải (D).
Môi trường thử khả năng sinh protease: MPA + cơ chất (0,1% Cazein), thuốc nhuộm lugol (5%) [44].
Môi trường thử khả năng sinh cellulase: MPA + cơ chất (0,1% CMC), thuốc nhuộm lugol (5%) [45].
Môi trường thử khả năng sinh chitinase: MPA + cơ chất (0,1% Chitin), thuốc nhuộm lugol (5%) [46].
3.3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn 3.3.3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không). Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn được quan sát, so sánh trên môi trường MPA ở nhiệt độ 35 - 37°C. Sau 24 - 48 giờ lấy mẫu quan sát kích thước khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường theo phương pháp của Bergey (1989) [15].
3.3.3.2. Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do
không bị rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương. Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm [5]. Vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím.
Cách tiến hành:
- Làm vết bôi với vi khuẩn nuôi cấy từ 16 - 24 giờ trên ống thạch nghiêng. Để vết bôi khô tự nhiên hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn. Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút.
- Nhuộm lugol trong 1 phút.
- Rửa bằng nước cất.
- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, - Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 - 30 giây.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên kính hiển vi với vật kính x100.
3.3.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng vi khuẩn được thể hiện khi nuôi trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn carbon (1,0%, w/v): D-glucose, D-maltose, Myo-inositol, D-mannitol, Saccharose, Cellobiose, D-fructose, Tinh bột tan. Sau 24 nuôi cấy, tiến hành đo OD dịch nuôi vi khuẩn [15].
Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ của chủng vi khuẩn được thể hiện khi nuôi trên môi trường khoáng có bổ sung các nguồn nitơ (1,0%, w/v): L- arginin, L-lysin, Methionin, Leusin, L-tryptophan, L-valine, L-alanine, Glycine. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi khuẩn và so sánh với môi trường đối chứng âm (môi trường MPA) [15].
Xác định pH nuôi cấy thích hợp: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường MPA lỏng có pH môi trường trong khoảng từ pH 4,0 đến pH 8,0. Sau 24 giờ tiến hành đo OD dịch nuôi vi khuẩn và so sánh kết quả từ đó chọn ra pH tối ưu nhất [15].
Xác định nhiệt độ, nồng độ NaCl thích hợp: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường MPA thạch ở các nhiệt độ khác nhau (20; 25; 30; 35; 45; 45 và 45°C) và trên môi trường MPA thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 0,5 - 2,0% (w/v) ở 37°C, sau 24 giờ tiến hành quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn [15].
3.3.4. Phân loại chủng vi khuẩn được tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA
Trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự được trình bày trong Bảng 3.1
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi khuếch đại gen 16S rDNA
Tên đoạn mồi Trình tự mồi
27F 5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’
1429R 5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn 1kb (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM-DNA Purification (Invitrogen, Mỹ) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST.
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên công thức thống kê:
Giá trị trung bình (X): X = i
Độ lệch chuẩn (δ): δ = Sai số (m):
Phần 4