CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp lấy mẫu máu: Dùng xilanh lấy một lượng máu tĩnh mạch và đưa vào ống eppendoft 2ml (có chứa chất chống đông EDTA), bảo quản trong tủ lạnh (-20oC) cho đến khi sử dụng.
2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ mẫu máu được tách chiết sử dụng bộ kit G-spin™ Total DNA Extraction Mini Kit của InTRON - Hàn Quốc. Các bước tách chiết cụ thể như sau:
Bước 1: Cho 200μl máu vào ống eppendorf 1,5ml.
Bước 2: Thêm 20μl Protease K + 5μl RnaseA, đảo bằng Voltex.
Bước 3: Thêm 200μl buffer BL Voltex nhẹ.
Bước 4: Ủ ở RT trong 2 phút.
Bước 5: Ủ ở 56oC trong 10 phút, đảo ngược ống 3 - 4 lần.
Bước 6: Ly tâm nhẹ (5000 v/p trong 2 phút) để kéo hết các giọt ở thành ống xuống.
Bước 7: Thêm 200μl EtOH 100%, đảo bằng Voltex.
Bước 8: Ly tâm nhẹ (5000 v/p trong 2 phút) để kéo hết các giọt ở thành ống xuống.
Bước 9: Hút dung dịch chuyển vào cột; ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, RT;
loại bỏ dịch trong ống, đặt cột trở lại.
Bước 10: Thêm 700μl buffer WA. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút; bỏ dịch đặt cột trở lại.
Bước 11: Thêm 700μl buffer WB. Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút; chuyển cột.
Bước 12: Ly tâm thêm 1 lần 13000 v/p trong 1 phút.
Bước 13: Đặt cột sang ống eppendorf 1,5ml mới, bổ sung 50μ buffer CE; ủ ở RT trong 1 phút, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.
Bước 14: Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.4.3. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi như trong bảng 2.3 và các thành phần phản ứng ở bảng 2.4, chu trình nhiệt được thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR.
Tên mồi Trình tự
Kích thước
dự
kiến
Nhiệt độ gắn
mồi
CSN1S1 – F1 CSN1S1 – R1
5’ TTCTAAACAAGGAGTTAGCAAC 3’
5’ CTGTACCATGAGACCTAATGG 3’
221bp 56oC
Bảng 2.4: Thành phần của một phản ứng PCR
Húa chất Thể tớch (àl)
H2O 5,8
Buffer 10X 1
dNTP 10mM 1
Mồi xuụi (Primer F) 10àM 0,5
Mồi ngược (Primer R) 10àM 0,5
Taq polymerase 5U 0,2
DNA khuôn 50ng 1
Tổng thể tích 10
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 95 5 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
35
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 5 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 Cho đến
khi tắt máy 2.4.4. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn hay còn được gọi là Endonuclease giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết phosphodiester ngay tại đó.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme cắt giới hạn cho gen CSN1S1 là MaeI. Sản phẩm PCR từ cặp mồi CSN1S1 được cắt bởi enzym MaeI.
2.4.5. Phân tích đa hình các gen
Sản phẩm PCR của cặp mồi sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, phân lập độ dài các đoạn DNA bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,8% - 1,2% với hiệu điện thế 80V trong 40 phút trong hệ đệm TAE. Sau đó nhuộm bằng Ethidium bromide và soi chụp dưới tia UV bằng Máy chụp gel “Gel logic 1500 - Kodak - USD”. Xác định kiểu gen cho từng cá thể dựa vào kết quả điện di.
2.4.6. Phương pháp điện di kiểm tra
Phương pháp điện di DNA dựa trên đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trường với hiệu điện thế và cường độ thích hợp chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường.
Phương pháp điện di được thực hiện phụ thuộc vào kích thước, cấu hình không gian của DNA, loại gel, nồng độ gel và cường độ dòng điện. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể sang lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước.
Các bước của phương pháp điện di được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị gel:
+ Sử dụng agarose 0,8% với 50ml.
+ Cân 0,4g agarose cho vào 50ml dung dịch TAE 1X.
+ Đun sôi bằng lò vi sóng để agarose hoà tan hoàn toàn (nồng độ gel 0,8%), làm nguội gel đến khoảng 60oC
+ Thêm 3μl Redsafe đổ vào khuôn cài lược sẵn, chờ gel đông hoàn toàn.
+ Sau khi gel đông lại, nhấc lược ra nhẹ nhàng tránh làm vỡ giếng, sau đó tách gel ra khỏi khuôn và đặt vào bể điện di.
+ Đổ dung dịch đệm TAE 1X vào bể điện di đủ để ngập hết bản gel.
- Tra mẫu điện di:
+ Sử dụng Loading Dye 6X => tỉ lệ mẫu được pha trộn là 5à mẫu + 1à Dye rồi mix đều tay (tránh tạo bọt khí).
+ Cài đặt chương trình điện di ở hiệu điện thế 80V, 400mA, 30W trong 40 phút (vị trí vạch Dye màu xanh đi được 2/3 bản gel là được).
+ Kiểm tra kết quả điện di và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.
2.4.7. Tinh sạch sản phẩm PCR
Những sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại thành công sẽ được tinh sạch bằng kit PCR Purification Kit của InTRON - Hàn Quốc, sử dụng phương pháp tinh sạch từ gel agarose với các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Chuyển tối đa 300mg gel vào ống Epp 2,0ml (nếu đã bảo quản gel trong ống rồi thì bắt đầu từ bước 2).
Bước 2: Thêm 500μl BNL buffer.
Bước 3: Ủ ở 55oC trong 10 phút, mỗi 2 - 3 phút thì lấy ra voltex một lần.
Sau 10 phút phải đảm bảo gel được tan hết vào đệm.
Bước 4: Để ống nguội ở RT. Đặt cột vào ống thu.
Bước 5: Chuyển 800μl hỗn hợp gel đã tan ở bước 3 vào cột. Ly tâm 11000 v/p trong 30s. Loại bỏ dịch thừa dưới ống thu, lặp lại một lần nếu lượng hồn hợp ở bước 3 nhiều hơn 800μl.
Bước 6: Thêm 750μl washing buffer vào cột. Ly tâm 11000 v/p trong 30s, loại bỏ dịch phía dưới cột.
Bước 7: Ly tâm 14000 v/p trong 3 phút để làm khô cột.
Bước 8: Đặt cột vào ống Epp 1,5ml mới.
Bước 9: Thêm 40μl dung dịch H2O vào giữa cột (tránh để đầu côn chạm vào màng gây rách màng). Đặt ở RT trong 1 phút.
Bước 10: Ly tâm 14000 v/p trong 1 phút. Thu được AND ở ống Epp, bảo quản ở 4oC để gửi đi giải trình tự.
2.4.8. Giải trình tự nucleotit
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch và kiểm tra nồng độ sẽ được gửi cho công ty 1st BASE của Malaysia để giải trình tự nucleotide sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing trên máy giải trình tự tự động.
2.4.9. Phương pháp phân tích số liệu
Trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu được xử lý, phân tích bằng các phần mềm tin sinh chuyên dụng như BioEdit 7.2, MEGA7 và các công cụ hỗ trợ
CHƯƠNG 3