Lấy 50 gam ph n cao chiết n-butanol tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel (Merck, c hạt 20 – 63 àm) với cột cú k ch thước 6x60 cm. Ổn định cột bằng dung môi dichloromethane. Hệ dung môi rửa giải là dichloromethane : ethanol với t lệ từ 7 : 1 – 1 : 1 (v/v). Tiến hành sắc ký thu được 6 phân đoạn.
Tại phân đoạn 2, tiến hành lọc chất rắn, sau đó rửa lại với ethanol rồi sấy khô, thu được chất rắn 1 màu trắng có khối lượng 12 mg. Tiến hành lọc chất rắn ở phân đoạn 3 và rửa lại với ethanol rồi sấy khô, thu được 14 mg chất rắn 2 màu trắng.
Chất rắn 1 và 2 sau khi làm khô sẽ được tiến hành đo phổ NMR và MS để xác định cấu tr c hợp chất (sơ đồ 2.2).
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ ph n ập h p chất 1 và 2 Cao chiết n-butanol
(50 gam)
Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3 Phân đoạn 4 Phân đoạn 5 Phân đoạn 6
SKC
Pha động: dichloromethane/ethanol với t lệ từ 7/1 đến 1/1
Chất rắn 2 Màu trắng Lọc lấy chất rắn,
rửa lại bằng ethanol, sấy khô Chất rắn 1
Màu trắng
Lọc lấy chất rắn, rửa lại bằng ethanol, sấy khô
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập h p chất 1
Hình 3.1. Phổ 13C-NMR của chất 1
Kết quả dữ liệu phổ 13C-NMR của chất 1 được tổng hợp trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số i u phổ 13C-NMR của chất 1 và h p chất so sánh V trí Số i u đo 13C-NMR (ppm) Số i u tham khảo 13C-NMR (ppm)[61]
1 29,31 29,60
2 28,73 27,58
3 68,13 66,84
4 31,78 33,65
5 140,59 140,78
6 121,47 124,32
7 31,24 30,55
8 31,74 33,22
9 37,87 40,11
10 37,08 34,95
11 20,63 20,54
12 41,35 39,54
13 36,65 38,33
14 56,01 56,14
15 31,19 31,6
16 80,44 81,01
17 49,85 50,11
18 19,23 16,41
19 16,28 15,65
20 17,33 14,33
21 40,04 42,11
22 108,66 109,7
23 19, 23 27,34
24 28,98 25,83
25 30,06 26,02
26 66,17 64,78
27 18,00 16,08
1’ 100,31 101,02
2’ 77,79 77,11
3’ 72,17 76,34
4’ 76,29 76,56
5’ 70,49 70,23
6’ 62,04 63,02
1’’ 98,41
2’’ 76,80
3’’ 70,85
4’’ 76,55
5’’ 70,74
6’’ 61,22
Phổ 13C-NMR của chất 1 xuất hiện 39 t n hiệu carbon, đặc biệt có t n hiệu của C-22 (δC = 108,66 và C-16 (δC = 80,44) của vòng spiro 5 và 6 cạnh. Trên phổ 13C- NMR của chất 1 cũng nhận thấy t n hiệu công hưởng của 02 carbon của liên kết bội tại C-5 (140,59 ppm) và C-6 (121,47 ppm). Ngoài ra, ta nhận thấy có 02 t n hiệu cộng hưởng của 02 nguyên tử carbon tại C-1’ (100,31 ppm) và C-1’’ (98,41 ppm).
Hình 3. 2. Phổ 1H-NMR của chất 1
Hợp chất 1 thu được sau tinh chế dưới dạng màu trắng. Phổ 1H-NMR thấy xuất hiện các t n hiệu của: T n hiệu cộng hưởng của nhóm methyl bậc ba tại δH = 0,68 (s), 0,92 (s); 01 nhóm methyl bậc 2 tại δH = 1,12 (J = 7,3 Hz); hai proton ở vị tr C-26 với δH = 3,89 (1H, m), δH = 3,41 (1H, m) và một proton ở C-16 với δH = 4,28 (1H, m).
Đặc biệt trên phổ 1H-NMR xuất hiện proton của liên kết đôi tại δH = 5,36 ppm (1H, m). Ngoài ra trên phổ 1H-NMR của chất 1 còn xuất hiện các proton của gốc đường, trong đó điển hình là 02 proton 1’ và 1’’ đặc trưng của các gốc đường tại tại δH = 5,06 và 4,36 ppm (1H, J = 7,6 Hz).
Để xác định thành ph n đường có trong hợp chất, ch ng tôi tiến hành thủy phân 5 mg chất rắn trong HCl 0,5M trong 15 ph t tại 70oC, sau đó tiến hành đối sánh với đường glucose, nhận thấy vết chất đường thu được cùng giá trị Rf = 0,47 (hệ dung môi MeOH/DCM = 1/1 v/v) trên bản TLC. Trên phổ HMBC của chất 1 cho thấy gốc đường thứ 2 liên kết với gốc đường thứ nhất tại vị tr C-3’.
Hình 3.3. Phổ HSQC của chất 1
Hình 3.4. Sự tương quan giữa H→C của chất 1 (HMBC
Hình 3.5. Phổ khối ƣ ng của chất 1
Phổ khối lượng của chất 1 cho thấy peak phổ (100%) là 757,44 [M H]+, kết hợp với phổ NMR của chất 1 và tham khảo tài liệu [61, 62] ta có thể nhận thấy công thức phân tử của chất 1 là C39H64O14, công thức cấu tạo tương ứng là:
Hình 3.6. Công thức cấu tạo của chất 1 (Anemarrhenasaponin III)
O
HO
O
HO
O
OH
O
HO
O
HO
HO
HO
OH
1 HO
2
4 6
7 8 9 11
12
13
14 15 16 17 18
19
20 21
22 23
24 25
26 27
1’ 2’ 3’
4’ 5’ 1’’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’
6’
5
7 10
3
3.2. Kết quả phân lập h p chất 2
Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của chất 2
Trên phổ 13C-NMR của 2 cho thấy có 39 t n hiệu cộng hưởng tương ứng với 39 nguyên tử carbon của khung aglycon nên sẽ có 12 nguyên tử C của 2 gốc đường.
Bốn nhóm methyl có các t n hiệu cộng hưởng tương ứng là 16,68 (CH3-18), 24,09 (CH3-19), 14,96 (CH3-21) và 16,41 (CH3-27). T n hiệu δ = 109,29 ppm tương ứng với nguyên tử carbon liên kết với 02 oxygen tại C-22. Bên cạnh đó, hai nguyên tử carbon có δC = 104,28 và 101,18 ppm nên có thể là hai nguyên tử H ở vị tr 1 của các gốc đường, và hai nguyên tử carbon có δC = 61,50 và 60,71 ppm là các nguyên tử carbon trong nhóm CH2 có liên kết với nguyên tử oxygen của gốc đường.
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của chất 2
Phổ 1H-NMR của chất 2 cho một t n hiệu của singlet tại δH 0,71 ppm (s, 3H) tương ứng với 3 proton của nhóm methyl liên kết với carbon bậc 4. Một t n hiệu singlet tại δH = 0,91 ppm (s, 3H) liên kết với carbon C-18. Hai t n hiệu ở δ = 0,95 ppm (J = 7,5 Hz) và 1,01 (J = 7,9 Hz) l n lượt tương ứng với 4 nhóm methyl liên kết với nhóm CH ở vị trí C-27 và C-21.
Ở H-26 có t n hiệu doublet ở δ = 3,21 (J = 10,7 Hz) của Hα và δ = 3,68 (dd, J = 10,7, 2,8 Hz, 1H) của Hβ là hai t n hiệu cộng hưởng của hai proton trong methylen (- CH2-) trong vòng no; ở H-16 có δ = 4,29 ppm (dd, J = 7,6, 4,3 Hz, 1H) cho thấy có nguyên tử H của carbon có liên kết C-O.
Ngoài ra, trên phổ có hai t n hiệu cộng hưởng là δH = 4,40 ppm (d, J = 7,8 Hz) và δH = 4,26 ppm (d, J = 7,6 Hz) liên kết với hai nguyên tử carbon có δC = 104,31 và 101,21 ppm nên có thể là hai nguyên tử H ở vị tr C-1 của các gốc đường.
Hình 3.9. Phổ HSQC của chất 2
Hình 3.10. Sự tương quan giữa H→C của chất 2 (HMBC
Trên phổ tương quan hai chi u HSQC và HMBC, ta nhận thấy các t n hiệu tương tác trực tiếp và gián tiếp của các nguyên tử carbon và hydrogen của hợp chất 2.
Phổ HMBC ch ra một số sự tương quan quan trọng giữa t n hiệu của methyl H-21 và t n hiệu C-20 và C-17; proton H-19 với H-21 và C-17. Ngoài ra, cấu hình 25R của hợp chất đang c n xác định cấu tr c được suy luận dựa trên sự khác nhau trong sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học của proton dạng geminal của H-26 (δ = 3,21) (Hα- 26) và (δ = 3,68) (Hβ-26) (∆αβ:0,47) trong khi sự khác nhau thông thường của hợp chất 25S là ≥ 0,57 còn 25R là < 0,57.
Để xác định thành ph n đường có trong hợp chất 2, ch ng tôi tiến hành thủy phân 5 mg chất rắn trong HCl 0,5M trong 15 ph t tại 70oC, sau đó tiến hành đối sánh với đường β-D-Glucose, nhận thấy vết chất đường thu được cùng giá trị Rf = 0,45 (hệ dung môi MeOH/DCM = 1/1 v/v) trên bản TLC và đối sánh với chất chuẩn là β-D- Glucose nhận thấy trong dịch thu được ch có β-D-Glucose. Do đó, trong phân tử chất 2 có hai gốc đường đ u là β-D-Glucose. Qua phổ HMBC nhận thấy gốc đường thứ hai liên kết với gốc đường thứ nhất ở vị tr carbon số 3.
Hình 3.11. Phổ khối ƣ ng của chất 2
Kết hợp với phổ khối lượng có peak ion m/z 774.15 [M+Na+H]-, kết hợp với phổ NMR nhận thấy chất 2 có công thức phân tử là C39H64O13. Dựa trên dữ liệu v phổ cộng hưởng từ hật nhân, kết hợp tham khảo tài liệu tham khảo [61, 62], có thể khẳng định chất 2 là dạng steroid glycoside, có công thức cấu tạo là:
Hình 3.12. Công thức cấu tạo của chất 2 (Timosaponin AIII)
3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt t nh độc tế bào trên dòng tế ào ung thƣ MCF7 Để đánh giá độc t nh của chất 1 lên tế bào ung thư, ch ng tôi đã tiến hành xử lý tế bào ung thư v MCF7 với cỏc nồng độ khỏc nhau từ 10 đến 20 àg/mL trong 48 giờ và m u trắng là các tế bào không được xử lý với chất 1 và đối chứng (control:
Doxorubicin). Kết quả được trình bày trong hình 3.13.
4 5 1
3
2 9 8
6 7 13 12 11
10
21
16 14 15
20 19
18
17 22
23
26 25 24 27
1’
2’
3’ 4’
5’
6’
1’’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’
M u trắng (chưa có chất 1) Chất 1 (10 μg/mL)
Chất 1 (20 μg/mL) Doxorubicin (0,7 μg/mL)
Hình 3.13. Ảnh hưởng của chất 1 ên sự tăng sinh và hình th i tế ào ung thư v MCF7
Kết quả hỡnh 3.13 cho thấy, ngay ở nồng độ thấp nhất (10 àg/mL) trong dóy nồng độ được thử, chất 1 đã ức chế sự tăng sinh của tế bào so với m u trắng. Mật độ tế bào giảm rõ rệt, nhi u khoảng trống trên b mặt nuôi cấy chưa được lấp đ y bởi cỏc tế bào. Rừ rệt hơn là ở nồng độ 20 àg/mL thỡ mật độ tế bào là thấp so với m u trắng. Bằng phương pháp phân t ch MTT với việc sử dụng hệ thống phân t ch độ hấp thụ quang giữa các giếng đối chứng và giếng xử lý với chất 1. Ch ng tôi đã t nh được giỏ trị IC50 của chất 1 là 15 àg/mL. So sỏnh với cỏc cụng bố trước đõy cho thấy IC50 ở 48 giờ xử lý của một số chất chống ung thư đối với dòng tế bào này như paxitacel 15,3 ± 2,00 μg thì chất 1 có tác dụng tương đương paxitacel nhưng kém hơn so với Doxorubicin.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ