5. Tình hình sử dụng kinh phí: đã hoàn tất thủ tục thanh/quyết toán với tổng
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống và nuôi cấy giống để thu dịch enzyme ngoại bào
Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng và (1978) và được mô tả như sau:
-Phương pháp hoạt hóa giống
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml môi trường NB, đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm, trong 20 phút. Dùng đầu que cấy nhọn tiệt trùng lấy khuẩn lạc và cho vào ống nghiệm. Nút miệng ống nghiệm bằng nút bông, đánh dấu tên chủng, thời gian cấy. Các thao tác thí nghiệm đều được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và dưới ngọn lửa đèn cồn. Sau đó, các ống nghiệm được chuyển vào tủ nuôi cấy, nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 24 giờ.
-Phương pháp nuôi cấy giống để thu dịch enzyme ngoại bào
Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa môi trường NB có bổ sung 1% đường lactose đã hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và nuôi cấy ở 37
oC, lắc 200 vòng/phút trong 24h. Tiến hành li tâm 6000 vòng/ phút ở 4oC trong 20
phút, gạn lấy phần dịch nổi bảo quản ở 4 oC để xác định khả năng sinh enzyme β – galactosidase.
3.3.2. Xác định khả năng sinh β- galactosidase bằng phương pháp đĩa thạch Khả năng sinh β-galactosidase của các chủng Bacillus được xác định theo phương pháp của Toru Nakayama và Teruo Amachi, 1996, được mô tả như sau:
Nguyên tắc: β-galactosidase thuỷ phân X-gal hình thành sản phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo. Vì vậy, vi khuẩn dương tính với enzyme này sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch bổ sung chỉ thị X-gal và chất cảm ứng IPTG hoặc lactose.
- Cách 1: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp cấy trang trên đĩa thạch
+ Môi trường NA được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó dùng micropipet hút, bổ sung 60 àl X-gạl nồng độ 20 mg/ml và 10 àl IPTG 0,1 M trờn mỗi đĩa, trang đều.
+ Hỳt 3 àl dịch khuẩn đó được hoạt húa ở phần 3.3.1 lờn cỏc đĩa thạch chỉ thị này, trang đều.
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 C, trong điều kiện⁰ tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.
- Cách 2: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp nhỏ dịch nuôi cấy trên đĩa thạch
+ Môi trường NA được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó dùng micropipet hút và bổ sung 60 àl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 àl IPTG 0,1 M trờn mỗi đĩa, trang đều + Hỳt 3 àl dịch khuẩn, đó được hoạt húa ở phần 3.3.1 nhỏ trờn bề mặt đĩa thạch chỉ thị, để khô dịch khuẩn trong 5 phút.
+ Đĩa làm xong được đưa vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37 C, trong điều kiện tối. ⁰ Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.
- Cách 3: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch
+ Môi trường NA được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó dùng micropipet hút và bổ sung 60 àl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 àl IPTG 0,1 M trờn mỗi đĩa, trang đều
+ Tiến hành lấy khuẩn lạc cấy ria chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 C, trong điều kiện⁰ tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.
3.3.3. Xác định hoạt độ của β-galactosidase ngoại bào
Hoạt độ của β-galactosidase được xác định theo phương pháp của Nguyen và cs, 2006, được mô tả như sau:
Nguyên tắc: Hoạt độ β-galactosidase được xác định bằng cách cho enzyme này phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG). Dưới tác dụng của β-galactosidase, oNPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. o- nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ (Abs) ở bước sóng cực đại 420 nm.
- Bước 1: Xây dựng đường chuẩn oNP
Các dung dịch 1 2 3 4 5 6
Vdung dịch gốc (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Vdung dịch đệm (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ (mM) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
Dùng 0.5ml oNP và 0.75ml Na2CO3 đo ở bước sóng 420nm, dựa vào sự tương quan giữa nồng độ oNP và giá trị OD ở bước sóng 420nm xác định được tốc độ phản ứng của oNP qua đường chuẩn dựng bằng phần mềm Excel.
Bảng 3.1. Số liệu dựng đường chuẩn oNP
STT 1 2 3 4 5 6
Nồng độ oNP (mM)
0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2
Abs 0.0045 0.1326 0.2624 0.3878 0.5078 0.6336
Hình 3.1 Đường chuẩn oNP - Bước 2: Xác định hoạt tính của enzyme
+ Hỳt 480 àl oNPG vào ống eppendorf 1,5ml, sau đú ống eppendorf được cho vào máy ổn nhiệt (thermomixer) ở 30oC, chờ 5 phút để nhiệt độ trong ống eppendorf đạt 30ºC trước khi đưa enzyme vào.
- Bắt đầu phản ứng bằng cỏch thờm 20 àl dung dịch enzyme ngoại bào (ở phần 3.3.1).
+ Lắc đều ở 600 vòng/phút trong 10 phút.
+ Dừng phản ứng enzyme bằng cỏch bổ sung 750 àl Na2CO3 0.4 M vào trong ống eppendorf.
+ Đo độ hấp quang trên máy so màu ở bước sóng 420 nm.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thớ nghiệm, trong đú 20 àl dung dịch enzyme được thay thế bằng 20 àl dung dịch đệm phosphate pH 6.5.
Thí nghiệm lặp lại 2 lần, sai số ở 2 thí nghiệm không được vượt quá 5%.
Tính kết quả:
Hoạt tính enzyme có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau:
Trong đó:
U/ml: Hoạt tính β- galactosidase
Abs420nm: Độ hấp thụ quang của phản ứng màu đo được tại
420 nm
Blank: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng SlopeoNPstandardcurve: Hệ số góc của đường chuẩn oNP
treaction: Thời gian phản ứng enzyme cơ chất (phút)
3.3.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy phân có đặc tính chịu nhiệt
Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase chịu nhiệt được xác định theo phương pháp của Nguyen và cs, 2012.
Để xác định khả năng chịu nhiệt của β-galactosidase, các enzyme này được ủ ở nhiệt độ 60ºC. Tại các thời gian ủ khác nhau, enzyme lấy ra để xác định hoạt độ (theo phương pháp mô tả ở mục 3.3.3). Độ bền nhiệt của enzyme được xác định bằng cách so sánh % hoạt độ còn lại của enzyme tại thời điểm đo với thời điểm bắt đầu ủ.
3.3.5. Định danh chủng được tuyển chọn bằng phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA
Chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase chịu nhiệt được xác định trình tự gen và so sánh mức độ tương đồng di truyền với các loài trên ngân hàng gen NBCI bằng công cụ BLAST theo phương pháp của Maxam và Gibert, 1997.
3.3.5.1. Quy trình chiết DNA
- Lấy 50 – 100 àl dịch khuẩn vào tube 1.5 ml
- Dịch nuôi được ly tâm ở 5000 vòng trong 10 phút để thu sinh khối. Dùng pipet hút cẩn thận dịch trong ra khỏi tube, giữ cặn.
- Hòa tan sinh khối trong 0.5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS).
- Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, siêu âm phá vỡ tế bào, 70% năng lượng , 5 phút bật/ 5 phút tắt.
- Bổ sung lysozyme 20 μg/ml, ủ ở nhiệt độ 370C trong 1h.
- Bổ sung 0.15 ml CH3COOK.
- Ly tâm 10000 vòng, dùng pipet hút cẩn thận phần dịch trong bên trên (khoảng 600 àl, khụng lấy phần phõn lớp).
- Bổ sung isopropanol tỉ lệ 1:1 so với thể tích dịch trong tube để kết tủa DNA.
- Lắc đều tube và để trong tủ -20ºC trong 30 phút.
- Ly tâm ở 13000 vòng trong 10 phút ở 40C để thu tủa DNA.
- Để lắng DNA, đổ dịch trong, thu DNA.
- Rửa tủa bằng cồn 70% 2 lần (mỗi lần dựng khoảng 500àl), sau đú cho vào mỏy spin.
- Làm khô cặn bằng cách mở nắp tube, để trong buồng cấy vô trùng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Hũa tan DNA trong 50àl nước cất 2 lần vụ trựng.
- Kiểm tra chất lượng mẫu chiết DNA bằng điện di gel agarose (dựng 1-2àl dịch DNA).
3.3.5.2. Nhân DNA bằng PCR và giải trình tự gen
- Sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng quốc tế: 27F/1492R, ới trình tự:
27F: 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
1492R: 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3’
- Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0,5ml với tổng thể tích phản ứng là 25àl, thành phần của mỗi phản ứng PCR gồm:
5 mM dNTPs : 1.5 àl
10X Taq Buffer : 2.5 àl
5 àM 27F : 1 àl
5 àM 1492R : 1 àl DNA template : 1 àl Taq DNA pol : 0.3 àl
H2O : 17.5 àl
Tổng thể tớch phản ứng : 25 àl - Chu trình nhiệt
95ºC 5 phút x1 vòng
95ºC 56ºC 72ºC
45 giây 1 phút
1 phút 30 giây
x30 vòng
72ºC 5 phút x1vòng
3.3.5.3. Chạy điện di
* Chuẩn bị:
- Dung dịch đệm TAE 0,5x.
- Bản gel: Cân 1g agarose cho vào 100ml TAE0,5x sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose. Sau đó đun trong lò vi sóng 3 – 4 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 4àl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phũng. Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 400C thì đổ vào khuôn có đặt lược khi tạo lỗ khuôn. Để khuôn ở nhiệt độ phòng.
- Các tube chứa 0,5ml chứa các sản phẩm PCR (đã đánh số thứ tự) cho vào mỗi tube 4àl loading Dye X6, đảo đều và spin trong 5 giõy.
*Tiến hành
- Sau 30 giây để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược.
- Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 0,5x phủ ngập gel.
- Nhỏ mẫu vào giếng: dựng pipet hỳt 7 - 10àl dung dịch mẫu cần chuẩn đoỏn cho vào mỗi giếng theo thứ tự. Ngoài các mẫu chạy PCR còn nhỏ thêm 1 giếng marker làm chuẩn.
- Cắm nguồn điện cho máy điện di. Đặt ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút, tắt máy điện di, đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kit tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp bằng mồi PCR tại hãng Firs-base, Malaysia.
3.3.5.3. Phân tích trình tự
Kết quả giải trình tự tự gene được so sánh với các trình tự gene đã được công bố từ trước tại NCBI (The National Center for Biotechnology Information) nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
3.3.6. Tinh sạch enzyme bằng bằng (NH4)2SO4
Tiến hành tinh sạch enzyme bằng cách cho từ từ (NH4)2SO4 bão hòa 30, 40, 50, 60 và 70% vào dịch nuôi cấy sau khi đã ly tâm khuấy cho tan hết. Sau đó để kết tủa trong tủ 40C trong vòng 1 giờ rồi ly tâm lấy tủa ( 6000 v/p ở 40C trong 5 phút). Phần dịch tủa được hòa tan bởi đêm photphate pH = 6,5. Dịch enzyme β- galactosiase tinh sạch được dùng để xác định hoạt tính và hoạt tính riêng từ đó xác định độ tinh sạch của enzyme và hiệu suất thu hồi của phương pháp (Nguyễn và cs, 2006).
Hoạt tính riêng của enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme.
Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein (U/mg protein) trong đó số đơn vị enzyme (hay hoạt tính enzyme U/ml) được xác định theo phương pháp 3.3.3, tổng hoạt tính được tính theo thể tích dịch enzyme cuối cùng thu được sau khi tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4. Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford, protein tổng số được tính theo thể tích dịch enzyme cuối cùng thu được sau khi tinh sạch bằng muối NH4)2SO4.
3.3.7.Phương pháp định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford Phương pháp xác định protein tổng số theo Bradford, 1976 được mô tả như sau:
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm.
Tiến hành:
Bước 1: Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn được sử
dụng là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và bền tới 1 giờ.
Dựng đường chuẩn protein:
Bảng 3.8 Pha dãy đường chuẩn protein
Ống nghiệm 1 2 3 4 5
BSA ( 1mg/ml)(àl) 80 60 40 20 10
Nước cất (àl) 20 40 60 80 90
Nồng độ BSA (mg/ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1
Hỳt từ mỗi ống nghiệm 25àl dịch protein chuẩn vào cỏc ống nghiệm khỏc cú chứa sẵn 1000àl thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, lắc đều bằng mỏy lắc vontex, để yên 20 phút trong bóng tối. Sau 20 phút, tiến hành đo dung dich bằng máy đo quang phổ kế ở bước sóng 595nm ta được các giá trị OD, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (mg/ml) với mật độ quang Abs595 ta được phương trình tuyến tính y= ax + b. Dựa vào đường tuyến tính y= ax + b ta tính được lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Kết quả : Đường chuẩn có phương trình y= 0.3161x + 0.0387, trong đó x giá trị BSA (mg/ml), y là giá trị OD ở bước sóng 595 nm (hình 3.2).
Hình 3.2 Đường chuẩn protein Bước 2: Mẫu thí nghiệm
Cỏc mẫu thớ nghiệm được làm tương tự, thay 25àl mẫu protein chuẩn bằng 25àl mẫu thí nghiệm. Lượng protein trong mẫu được tính dựa vào phương trình đường chuẩn protein:
x = Trong đó:
x: là lượng protein trong mẫu (mg) y: là OD595 đo được của mẫu.
3.3.8 Phương pháp xác định đặc tính của enzyme β- galactosidase
3.3.8.1 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của enzyme β- galactosidase Xác định nhiệt độ tối thích của enzyme β- galactosidase như trình bày ở 3.3.3.
ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (20, 300C, 370C, 400C, 500C, 550C, 600C, 650C, 700C, 750C, 800C). Các điều kiện thí nghiệm và thời gian thí nghiệm như phần 3.3.3.
chỉ khác nhau về nhiệt độ phản ứng.
Sau khi xác định được nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân, chúng tôi tiến hành xác định độ bền nhiệt của enzyme tại nhiệt độ tối ưu và 600C, tại các thời gian khác nhau, enzyme được lấy ra để xác định hoạt tính. Hoạt tính của enzyme được xác định như phần 3.3.3. Thời gian được kéo dài tới thời gian bán hủy của enzyme (thời gian mà hoạt tính enzyme còn 50%).
3.3.8.2 Phương pháp xác định pH tối ưu và độ bền pH
Tiến hành thử nghiệm với các mức pH từ 3 đến 8 trong đệm Britton- Robinson (40mM sodium citrate, 40mM sodium phosphate, 40mM borate, sử dụng NaOH 0,2M để chỉnh pH về giá trị mong muốn). Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào cách xác định hoạt tính enzyme chuẩn như phần 3.3.3.
Độ bền pH được xác định tại các pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 ở 370C. Tại các thời điểm khác nhau, enzyme được lấy ra để xác định hoạt tính, hoạt tính của enzyme được xá định như phần 3.3.3. Thời gian được kéo dài đến thờ gian bán hủy của enzyme (thời gian mà hoạt tính enzyme còn 50%).
3.3.8.3. Phương pháp xác định sự ảnh hưởng của các cation kim loại đến hoạt tính của enzyme β- galactosidase
Các cation kim loại được bổ sung vào cơ chất oNPG trong đệm phosphate với nồng độ là 5-15 mM, sau đó phản ứng được tiến hành như với phản ứng enzyme chuẩn trong phần 3.3.3 và xác định hoạt tính enzyme β-glalactosidase. Sự ảnh hưởng của các cation kim loại đến hoạt tính enzyme β-glalactosidase được xác định bằng cách so
sánh hoạt tính của enzyme trong các mẫu có cation và không có cation thêm vào trong cùng điều kiện. Phản ứng thực hiện có mặt của các cation Ca2+, Cu2+, Fe2+, K+, Zn2+.
PHẦN THỨ TƯ – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN