CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại thảo dược
3.2.2.1 Phương pháp trích cao bằng dung môi ethanol 70%
Toàn thân các thảo dược sau khi thu về được định danh bởi tiến sĩ Đặng Minh Quân (Giảng viên trường Đại học Cần Thơ, giảng dạy môn Phân loại Thực vật). Mẫu được loại bỏ các phần bị sâu, bị úng, rửa sạch và để ráo. Lấy mỗi loại thảo dược 5 g để xác định độ ẩm. Cân tiếp mỗi loại thảo dược lấy 3 kg, sấy khô bằng tủ sấy ở 60°C trong thời gian 96 giờ, rồi đem xay thành bột. Bột cây được cho vào các túi vải và ngâm với ethanol 70% với tỉ lệ 1:10 (w/v) trong thời gian 72 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc với đường kớnh lỗ 13 àm. Phần bó sau chiết được bỏ đi. Phần dịch chiết được cô quay ở nhiệt độ 50°C, áp suất 100 mbar để loại bỏ dung môi. Tiến hành đông khô chân không để loại bỏ nước. Cân khối lượng cao chiết thu được và tính toán hiệu suất trích cao. Mẫu cao chiết được trữ ở 4°C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hiệu suất trích cao được tính theo công thức:
Độ ẩm nguyên liệu được xác định theo phương pháp của Willits (1951).
Nguyên tắc của phương pháp là dùng nhiệt độ làm bay hơi hết nước trong mẫu, Hiệu suất trích (%) =
Khối lượng bột cây trước khi ngâm (g) Khối lượng cao chiết sau khi cô quay (g)
× 100%
51
cân khối lượng mẫu trước và sau sấy khô, từ đó tính phần trăm lượng nước có trong mẫu.
Phương pháp tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu: Cốc được sấy ở nhiệt độ 105°C, khoảng 4 giờ. Lấy ra cho vào bình hút ẩm, để nguội, cân và ghi nhận khối lượng cốc (lặp lại cho đến khi khối lượng cốc không đổi). Cân 5 g các nguyên liệu thảo dược mẫu cho vào cốc (ghi nhận lại khối lượng mẫu và cốc trước khi sấy). Cốc có chứa mẫu được tiếp tục sấy ở 105°C khoảng 4 giờ, sau đó cho vào bình hút ẩm, để nguội, cân để ghi nhận lại khối lượng mẫu và cốc sau khi sấy (lặp lại đến khi khối lượng cốc và mẫu không đổi). Mỗi nguyên liệu được lặp lại 3 lần.
Độ ẩm của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa khối lượng tươi và khối lượng khô được tính theo công thức:
Chỉ tiêu theo dõi: độ ẩm của nguyên liệu và hiệu suất trích
3.2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol được chiết từ 8 loại thảo dược
- Nguyên tắc: Enzyme XO xúc tác phản ứng tạo thành acid uric theo phản ứng
Xanthine + O2 + H2O Acid uric + H2O2
Độ hấp thụ tia UV của hỗn hợp ở bước sóng 290 nm khi có và không có mẫu thử được sử dụng để xác định hoạt tính ức chế enzyme XO. Chất có khả năng ức chế enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế khả năng hình thành acid uric, do đó giá trị mật độ quang sẽ càng giảm.
- Chuẩn bị cao chiết: Cao ethanol 10 mg/mL được pha trong dung môi dimethyl sulfoside 0,1 M. Sau đó, cao ethanol của mỗi loại thảo dược được pha loãng thành các nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 μg/mL.
Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3635 theo phương phỏp của Nguyen et al. (2004). Hỗn hợp phản ứng 200 àL trong mỗi giếng thử bao gồm 50 àL dung dịch cao chiết, 35 àL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5), 30 àL dung dịch enzyme XO, ủ ở điều kiện 25°C trong 15 phỳt, tiếp theo cho thờm 60 àL dung dịch xanthine ủ ở 25°C trong 30 phỳt. Sau đú, 5 àL HCl 1 N được thờm vào để ngừng hoạt động của enzyme XO.
Cuối cùng mẫu được đo ở bước sóng 290 nm để xác định lượng acid uric tạo thành. Cao ethanol của từng thảo dược được sử dụng với các nồng độ 0; 6,25;
XO Độ ẩm (%) =
Khối lượng tươi (g)
Khối lượng tươi (g) – Khối lượng khô (g)
× 100%
52
12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 àg/mL. Trong đú, nghiệm thức sử dụng nồng độ 0 àg/mL là nghiệm thức đối chứng. Mỗi nồng độ được tiến hành lặp lại 3 lần.
Song song với mỗi mẫu thử có 1 mẫu trắng. Mẫu trắng là mẫu được thực hiện tương tự như mẫu thử, nhưng HCl được cho vào hỗn hợp trước khi cho enzyme XO vào hỗn hợp nhằm tạo môi trường để enzyme không hoạt động được. Hỗn hợp các dung dịch trong từng giếng được bố trí như Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng Giếng đối
chứng (àL)
Giếng đối chứng thuốc (àL)
Các giếng thử (àL)
Dung dịch cao chiết 0 0 50
AP 0 50 0
Đệm phosphate 85 35 35
Xanthine 60 60 60
XO 30 30 30
HCl 25 25 25
Tổng thể tích 200 200 200
Phần trăm ức chế được tính theo công thức
% ức chế = [(∆Ađối chứng - ∆Athử)/∆Ađối chứng] ×100
Trong đó: A là độ hấp thu quang phổ của mẫu ở bước sóng 290 nm ∆Ađối chứng = Ađối chứng - Amẫu trắng của mẫu đối chứng
∆Athử = Athử - Amẫu trắng của mẫu thử
Hiệu quả ức chế của cao ethanol được xác định dựa vào hiệu suất ức chế và giá trị IC50. Giá trị IC50 được tính dựa vào phương trình tuyến tính của từng cao chiết.
- Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất ức chế hoạt động của enzyme XO và giá trị IC50.
Hiệu suất ức chế hoạt động của enzyme XO được tính theo công thức:
3.2.2.3 IC50 và cách xác định
Định nghĩa: IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzyme. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
H = Độ hấp thu của mẫu đối chứng
Độ hấp thu của mẫu đối chứng – Độ hấp thu của mẫu thí nghiệm
× 100%
53 Cách xác định IC50:
Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50;
100; 200; 400 và 800 àg/mL. Với mỗi loại thảo dược, chọn ớt nhất 5 giỏ trị cú hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, một đường thẳng y=ax+b qua tất cả các điểm được vẽ với y là % ức chế và x là nồng độ. Thay y=50% vào phương trình sẽ thu được giá trị x. Đó chính là nồng độ ức chế được 50% enzyme (IC50).
Cao chiết có khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.