Do tín hiệu của mẫu do đầu dò thu được giảm khi nhiệt độ môi trường tăng lên, không nên cài đặt nhiệt độ buồng đo quá cao. Tuy nhiên, nhiệt độ buồng đo phải cao hơn nhiệt độ của đèn quang học của đầu dò – nơi chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi trường. Do nhiệt độ trong phòng thí nghiệm của chúng tôi là khoảng 30˚C, nghiên cứu này lựa chọn cài đặt nhiệt độ của buồng đo là 45˚C, cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 15˚C – như hướng dẫn của nhà sản xuất.
Độ nhạy của đầu dò
Cài đặt độ nhạy của đầu dò = 5 là giá trị trung bình trong thang độ nhạy của đầu dò FLD. Độ nhạy của đầu dò = 5 không quá nhỏ, tránh làm giảm chiều cao pic và gây ra tỉ lệ S/N không tối ưu. Độ nhạy của đầu dò được cài đặt quá cao cũng làm tín hiệu của ống quang tử bão hòa gây giảm tuổi thọ của đèn Xenon.
3.1.2. Xác định nồng độ dung dịch khảo sát
Tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml với bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm, sắc ký đồ thu được thể hiện trong hình 6.
Hình 6. Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Trong trường hợp này độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử ≥ 100%, tiến hành pha loãng dung dịch 4 lần, sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 100 ng/ml cho pic cân xứng (As = 1,21) với thời gian lưu 3,78 phút (hình 7). Tín hiệu thu được khoảng 19.000.000 counts trùng với mức độ nhạy của đầu dò = 5 trên thang độ nhạy của đầu dò FLD. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, chọn nồng độ 100 ng/ml là nồng độ lớn nhất của khoảng định lượng. Tại đây tín hiệu của ống quang tử chưa bão hòa.
Hình 7. Sắc ký đồ của dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 100 ng/ml Như vậy, chọn tiến hành nghiên cứu với khoảng định lượng 5 – 100 ng/ml và thẩm định khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.
3.1.3. Xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu Trong nghiên cứu này, để sơ bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu, chúng tôi quét phổ dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 50 ng/ml đồng thời bước sóng kích thích trong dải 200 – 400nm và bước sóng phát xạ trong dải 275 – 475nm (luôn chênh so với bước sóng kích thích một khoảng 75nm cố định), cài đặt tốc độ quét trung bình. Kết quả cho thấy sơ bộ mẫu có độ kích thích cực đại ở bước sóng kích thích λEx = 245nm, độ phát xạ cực đại ở bước sóng nằm trong khoảng 310 – 370 nm (hình 8).
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 8. Sơ bộ khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu Để xác định bước sóng phát xạ tối ưu, tiếp tục quét phổ dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 50 ng/ml, cài đặt bước sóng kích thích λEx = 247nm để quét phổ bước sóng phát xạ trong dải 270 – 400nm, cài đặt tốc độ quét trung bình. Kết quả cho thấy mẫu có độ phát xạ cực đại ở bước sóng phát xạ λEm = 312nm.
Hình 9. Khảo sát bước sóng phát xạ cực đại
Sử dụng bước sóng phát xạ tối ưu λEm = 312nm đã khảo sát để quét phổ bước sóng kích thích trong dải 200 – 300nm, cài đặt tốc độ quét trung bình, kết quả cho thấy mẫu có độ kích thích cực đại ở bước sóng kích thích λ =
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
247nm.
Hình 10. Khảo sát bước sóng kích thích cực đại
Như vậy đã chọn được điều kiện sắc ký tối ưu là pha tĩnh cột silica gel pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm), pha động là hỗn hợp acetonitril : nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút.
Mẫu được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký 8 phút. Hệ thống sử dụng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích λEx = 247nm và bước sóng phát xạ λEm = 312nm, nhiệt độ của buồng đo là 45˚C, độ nhạy của đầu dò = 5. Tại đây flurbiprofen có thời gian lưu 3,78 phút, pic cân xứng (As = 1,19), số đĩa lý thuyết 1866,24. Sắc ký đồ thu được thể hiện trong hình 11.
Hình 11. Sắc ký đồ ở điều kiện tối ưu hóa với đầu dò FLD
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Thời gian lưu 3,78 phút ngắn hơn so với thời gian lưu 5 phút khi xác định flurbiprofen trong huyết thanh người bằng phương pháp HPLC – FLD, sử dụng cho mục đích nghiên cứu dược động học [9].