Phần 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.2. Nghiên cứu đặc sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-07
Chủng virus KTY-PRRS-07 phân lập được tại Thái Bình năm 2014 Dụng cụ : Máy PCR , máy ly tâm, bộ điện di, buồng đếm Neubauer, tủ ấm, lò vi sóng...
Hóa chất: DMEM, FBS, PBS, Trypsin − EDTA, DMSO, Agarose 1.2%...
Phương pháp nuôi cấy tế bào
Để chuẩn bị cho các bước nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lượng tế bào Marc-145 buồng đếm Neubauer cần thiết.
24
- “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FBS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FBS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường DMEM + 5% FBS.
Bước 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
- Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin − EDTA. Thêm 7 ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6 ml mụi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loóng tế bào 100 lần (10 àl tế bào trong 990 àl mụi trường khụng đầy đủ) dựng buồng đếm đếm số tế bào trờn kớnh hiển vi, tớnh số tế bào trong 1 ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6 ml/bình T25, 15 ml/bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Thu tế bào
Sau khi có đủ lượng tế bào cần thiết, tế bào được thu và bảo quản để tiếp tục sử dụng những lần khác. Mỗi tế bào thường có một giới hạn nhất định về số lần nuôi cấy, thực chất là số lần phân chia tế bào, trừ tế bào ung thư có khả năng
25
phân chia vô hạn. Vì thế, trong các lần cấy chuyển và thu hoạch cần ghi hồ sơ theo dõi tế bào để đảm bảo chất lượng tế bào cho nghiên cứu.
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1 ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -200C trong 2 − 3 giờ, chuyển sang -800C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
- Phương pháp đếm tế bào
Việc đếm tế bào được thực hiện trước khi nuôi cấy tế bào và xác định đường cong sinh trưởng của virus. Mật độ tế bào trước khi nuôi cấy tế bào có liên quan đến hiệu quả của quá trình nuôi cấy, nhất là nuôi cấy tế bào một lớp. Khi xây dựng đường cong sinh trưởng của virus, đếm tế bào là việc làm cần thiết để gây nhiễm virus theo một tỉ lệ thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi gây nhiễm virus ở MOI = 0,01, tức là theo tỉ lệ 1 virus/ 100 tế bào.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng buồng đếm Neubauer để đếm tế bào.
Vị trí đếm áp dụng giống như đối với đếm hồng cầu. Đếm số lượng tế bào trong 5 ô đếm hồng cầu và tính theo phương pháp của Nguyễn Thị Lan và cs., 2005.
Phương pháp xác định hiệu giá virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2.0×104 tế bào/giếng).
Dịch nổi được hút bỏ và huyền phù virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trờn bề mặt tế bào một lớp của cỏc giếng theo thứ tự đỏnh dấu trước (25àl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 10%
TBP được bổ sung vào (100àl/giếng)
CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm.
TCID50 được xác định theo phương pháp của Reed-Muench.
Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5x104 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên.
Virus PRRS phân lập được và chủng virus vacxin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0.01. Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus
26
được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0.5ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100àl/giếng.
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ sau gây nhiễm virus.
Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus.
Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là lg của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus.
Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR - Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn 1
2
3 4
27
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
+ Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 ul Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
+ Chuẩn bị mẫu: Thờm 2 àl loading dye vào 8 àl sản phẩm RT-PCR
+ Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
+ Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tớch 6àl maker 100bp và 10àl sản phẩm PCR mỗi giếng.
+Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
+Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
Phương pháp giải trình tự gen
Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger. Khi sợi DNA được tổng hợp sẽ sử dụng các nucleotide có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng, trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:
Thành phần DTCS Quick Start Master Mix DNA
Primer dH2O
Tổng thể tích
28
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau Bước tổng hợp
Biến tính chuỗi DNA Gắn mồi
Kéo dài chuỗi DNA
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ)
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự.
Phương pháp xử lý số liệu
- Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được thông qua chương trình Blast trên Ngân hàng gen (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Truy cập ngân hàng gen thu nhận và xác định sự tương đồng về nucleotide của các chuỗi gen tương ứng của virus với các phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu. Thành phần aminoaxit của kháng nguyên virus được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (Bộ mã vi khuẩn – bacterial code) có trong ngân hàng gen và so sánh thông qua chương trình Genetyx. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm ClustalW.
- Xử lý bằng phầm mềm Microsoft Excel 2007 các số liệu trên để nắm được tình hình chăn nuôi lợn và tình hình dịch PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải Dương năm 2014.
29