1.1 Các hợp chất phenolic thực vật
1.1.4 Phương pháp chiết và phân lập các hợp chất phenolic
1.1.4.2 Phương pháp phân lập và tinh chế
Các phần chiết thực vật thô thường chứa một lượng lớn các hợp chất cacbohydrat hoặc nguyên liệu lipoid và hàm lượng của các hợp chất phenolic trong phần chiết thực vật thô có thể thấp. Để cô đặc và có được phân đoạn giàu polyphenol, qui trình bao gồm: chiết lần lượt hoặc phân bố hai pha lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) dựa trên độ phân cực và axit thường được sử dụng. Nói chung, việc loại bỏ nguyên liệu lipoid có thể đạt được bằng cách rửa phần chiết thô với các dung môi không phân cực như hexan, diclometan, hoặc cloroform.
Trong quá trình phân lập và tinh chế SPE được sử dụng để loại bỏ các hợp chất không phenolic như các đường và axit hữu cơ. SPE đang trở thành phổ biến vì là kỹ thuật nhanh, nhạy và kinh tế và vì các cột và đĩa SPE với các chất hấp phụ khác nhau có thể được sử dụng. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể được tự động hóa. Các cột C18 đã được sử dụng rộng rãi nhất trong phân tách các hợp chất phenolic. Sau khi các mẫu dung dịch được đưa qua các cột C18 đã được ổn định trước, các cột được rửa bằng nước axit để loại bỏ các đường, axit hữu cơ và các thành phần tan trong nước khác.
Các polyphenol sau đó được rửa giải bằng metanol tuyệt đối hoặc dung dịch nước aceton. Phân tách tiếp các hợp chất phenolic đạt được bằng cách điều chỉnh pH của mẫu cũng như độ pH và độ phân cực của các hệ dung môi. Ví dụ, Pinelo và cộng sự đã điều chỉnh độ pH của mẫu rượu vang loại ancol đến pH 7.0 và rửa giải hỗn hợp các axit phenolic với nước trong phân đoạn đầu [28]. Theo bước này, cột C18 được rửa axit với dung dịch HCl 0,01M và các phenol không polyme như các catechin, anthocyanin, và flavonol được rửa giải với etyl acetat. Cuối cùng, một hỗn hợp aceton, nước và metanol được sử dụng để rửa giải các phenol dạng polyme.
Các chất hấp phụ khác như Amberlite XAD-2, XAD-7, XAD-16, Oasis HLB [16, 20, 34] cũng đã được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic trong các phần chiết thô hay của các mẫu rượu vang. Sự so sánh một vài cột SPE bao gồm Amberlite, C8 silica gel, copolyme HLB, PH, ENV và MCX C18 silica gel để phân lập các hợp chất phenolic trong rượu vang ở nồng độ thấp cho thấy rằng phương pháp SPE với cột HLB
có độ nhạy cao hơn, độ thu hồi và khả năng nạp mẫu cao hơn cột C18 và cột HLB có thể là một sự thay thế tốt cho cột C18 để phân lập các hợp chất phenolic của rượu vang.
Sắc ký cột cũng đã được sử dụng để phân tách các phần chiết phenolic. Mặc dù phương pháp này thường tốn nhiều công sức và tiêu thụ dung môi nhưng nó tạo lượng lớn các phân đoạn tiếp theo cho sự phân lập và xác định các chất tinh khiết. Các chất hấp phụ cột thường sử dụng là RP-C18, Toyopearl, LH-20 và với mức độ ít hơn nhựa polyamit [29]. Etanol, metanol, aceton và nước là các dung môi rửa giải thường được sử dụng. Đặc biệt, sự phân lập các proanthocyanidin (tannin ngưng tụ) thường xuyên được thực hiện bằng cột sắc ký Sephadex LH-20 [3, 12]. Phần chiết thô được đưa lên và rửa giải bằng metanol hoặc etanol, chất không tannin sau đó rửa giải với aceton nước hoặc rượu-nước để nhận được các proanthocyanidin. Sử dụng cột sắc ký LH-20, methanol thường được dùng hơn etanol để rửa giải các chất không tannin. Hệ dung môi aceton-nước tốt hơn so với hệ dung môi etanol-nước để rửa giải các procyanidin từ cột, đặc biệt là các procyanidin dạng polyme. Trong một số trường hợp, hệ thống HPLC điều chế cũng đã được sử dụng để tinh chế mẫu polyphenol [2, 9].
1.1.4.3 Phân tích và xác định cấu trúc
Các polyphenol cho sự hấp thụ ở vùng UV và UV/VIS. Do đó các phương tiện phổ biến nhất để phát hiện các hợp chất phenolic được ghép nối với sắc ký lỏng (LC) là các đetectơ UV/VIS, PDA và UV-huỳnh quang. PDA là phương pháp phổ biến nhất vì nó cho phép quét phổ UV/VIS của tất cả các chất tan đi qua đetectơ, cung cấp thông tin của các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp như các phần chiết thực vật thô. Các phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các hợp chất phenolic bao gồm: kỹ thuật điện hóa (ECD), điện lượng kế, PDA và phát hiện chuỗi điện tử (EAD) được kết nối online, kỹ thuật phát hiện phản ứng hóa học, phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Các kỹ thuật điện di bao gồm điện di mao quản (CE), vùng điện di mao quản (CZE), sắc ký điện động Mixen kết hợp với phổ UV và ít hơn sự nhận
dạng EC và MS cũng được sử dụng để phân tích các hợp chất phenolic [14].
Sơ đồ quy trình phân lập và phân tích các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực vật được trình bày trong Sơ đồ 1.1.
Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic Làm khô không khí, làm khô đông lạnh Xay
Nghiền Đồng nhất Xử lý thô
Ngâm chiết Chiết MAE UAE
PFE (PLE/ASE, SWE, SFE) Chiết
SPE Sắc ký cột CCC Phân lập
Tinh chế
Các thử nghiệm quang phổ kế: FD, F-C, … GL/LC/điện di với phân tích công cụ (UV/VIS, FLU, PDA, EAD, điện lượng kế, ECD, MS, NMR)
Phân tích