Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS
44
MALDI-TOF MS chúng tôi đã xác định đƣợc các peptide trong mẫu thủy phân protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị. Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hoành biểu diễn khối lƣợng của peptide (đơn vị dalton) và trục tung biểu thị độ lớn của tín hiệu tương ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV) (hình 9).
Hình 9. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân protein T17B33 bằng enzyme trypsin
Sau khi phân tích khối phổ protein được nhận dạng theo phương pháp PMF.
Khối lƣợng của các peptide đƣợc tạo ra sau khi thủy phân đƣợc so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot thông qua website w.w.w.
matrixscience.com. Kết quả nhận dạng là một danh sách các protein phù hợp trong cơ sở dữ liệu và một số thông tin cơ bản nhƣ tên protein, ký hiệu, khối lƣợng phân tử, trình tự peptide phù hợp, score… Tuy nhiên, protein tra đƣợc phải có score lớn hơn 64 (độ tin cậy lớn hơn 95%). Khi đó, protein tra đƣợc sẽ biểu thị bằng cột màu đỏ, tách ra khỏi vùng màu xanh không có ý nghĩa. Thông tin chi tiết về protein tra đƣợc bao gồm khối lƣợng phân tử và giá trị pI trên lý thuyết, tổng số lƣợng các mảnh peptide đƣợc đƣa vào cơ sở dữ liệu, tổng số lƣợng peptide phù hợp với cơ sở dữ liệu. Ngoài ra, phần mềm còn đƣa ra trình tự amino acid của protein đƣợc tra phù hợp với cơ sở dữ liệu (hiển thị bằng phần màu đỏ trong trình tự). Kết quả nhận
45
dạng protein T17B31 trên bản gel mẫu mô ung thư đại trực tràng theo phương pháp này đƣợc mình họa ở hình 10.
46
Hình 10. Kết quả nhận dạng protein bằng tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần mềm Mascot
Các spot biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ đại trực tràng và mô bình thường trên tất cả các bản gel 2-DE dài 17cm của 5 bệnh nhân được tiến hành phân tích khối phổ. Khi so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot đã nhận dạng đƣợc 41 protein trong đó 29 protein đã đƣợc định danh và 12 protein giả thuyết (bảng 6).
48
Bảng 6. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI TOF-MS từ bản gel mô ung thƣ so sánh với bản gel mô đại trực tràng bình thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng
STT Spot Ký hiệu trong
NCBI Tên protein KLPT
(Da) Pi
Điểm theo hệ thống MASCOT
Tỷ lệ % phù hợp
Biểu hiện
1. T17B5 Q8NBP6 Hypothetical protein NT2RP2000636 84.002 9,10 68 9 ↑
2. T17B25
gi|29292410 Immunoglobulin heavy chain 10.137 5,25 64 12 ↑
T17B135
3. T17B28 gi|119612397 TAF2 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 150kDa, isoform CRA_a
119.143 8,17 68 14 ↑
T17B33
4. T17B31 gi|55769537 Zinc finger protein 658 125.674 8,63 70 10 ↑
5. T17B38 Q15374 GARS protein 46.585 6,34 69 17 ↑
6. T17B108 gi|340764274 Immunoglobulin heavy chain variable region
14.793 8,56 86 39 ↑
7. T17B162 YD49_HUMAN Hypothetical zinc finger protein KIAA1349 88.217 9,29 63 10 ↑
8. T17T100 Q9NXL8 Hypothetical protein ELJ20171 40.482 8,11 65 20 ↓
9. T17T116 CAD83811 Sequence 1 from patent WO02063009 24.950 8,52 65 20 ↓ 10. T17T120 GO1496 Transcription factor IIIA (Fragment) 39.762 9,33 69 32 ↓
49 STT Spot Ký hiệu trong
NCBI Tên protein KLPT
(Da) Pi
Điểm theo hệ thống MASCOT
Tỷ lệ % phù hợp
Biểu hiện
11. T17T139 Q96M66 Hypothetical protein FLJ32790 20.953 9,60 64 27 ↓
12. T17T178 S53351 Malate dehydrogenase (oxaloacetate – decarboxylating) (NADP) (EC 1.1.1.40) precursor, mitochondrial
67.639 7,92 65 13 ↓
13. TTB87A K2C1_HUMAN Keratin, type II cytoskeletal 1 (Cytokeratin 1) (K1) (CK 1) (67 kDa cytokeratin)
66.170 8,16 65 19 ↑
14. TTB87B ATHUC Actin, cardiac muscle 42.334 5,23 83 38 ↑
15. TTB87C Q16846 Tyrosine hydroxylase (EC 1.14.16.2) (FRAGMENT)
11.503 6,37 67 37 ↑
16. TTB116 gi|85396888 Protein tyrosine phosphatase, receptor type, S 169.480 6,16 83 13 ↑ 17. TTB119 CAB58611 Sequence 1 from patent WO9318147 22.885 6,22 64 24 ↑
18. TTT84 G01523 Heat shock protein 27 – human 27.094 8,24 67 26 ↓
19. TTT97 Q86YT1 Acyl-coenzyme A synthetase ACSM2B, mitochondrial
64.760 8,36 71 14 ↓
20. CB29 gi|51127397 Mutated CMP-sialic acid transporter A1 12.088 8,90 73 38 ↑
21. CB51 gi|4502517 Carbonic anhydrase 1 28.909 6,59 84 25 ↑
50 STT Spot Ký hiệu trong
NCBI Tên protein KLPT
(Da) Pi
Điểm theo hệ thống MASCOT
Tỷ lệ % phù hợp
Biểu hiện
22. CT16 Q9H019 Hypothetical protein 32.407 5,62 77 29 ↓
23. CT22 S55041 Proteasome endopeptidase complex (EC 3.4.25.1) beta chain C10-II-human
23.201 6,14 65 22 ↓
24. CT27 B38431 Myc- binding factor Max, short form 17.191 6,07 63 26 ↓
25. CT38 Q8NHR9 Similar to data source: SPTR, source key:
P39825, evidence: ISS putative related to PROFILIN
14.481 8,76 65 34 ↓
26. CT40 AAA76850 Creatine kinase (EC 2.7.3.2) chain B 42.786 5,27 71 18 ↓
27. CT41 gi|194376310 Unnamed protein product 38.950 5,19 67 29 ↓
28. CT59 Q29856 MHC class I (fragment) 21.381 6,24 67 32 ↓
29. CT67 gi|4501889 Actin, gamma-enteric smooth muscle isoform 1 precursor
42.249 5,31 82 29 ↓
30. CT74 gi|82408340 Chain A, Crystal Structure Of Diras2 In Complex With Gdp And Inorganic Phosphate
19.588 6,81 80 21 -
31. CT79 gi|154959417 Suppressor of tumorigenicity 20 protein 9.189 8,52 68 60 -
32. CT82 AAH33813 BCO33813 NID 29.310 5,23 72 19 -
51 STT Spot Ký hiệu trong
NCBI Tên protein KLPT
(Da) Pi
Điểm theo hệ thống MASCOT
Tỷ lệ % phù hợp
Biểu hiện 33. CT86 gi|4099605 Translational activator GCN1, partial 109.122 5,91 70 12 -
34. CT94 Q8IZJ2 Plexin D1 196.552 6,55 77 10 ↓
35. CT96 gi|28175105 ZFYVE26 protein, partial 55.592 8,90 81 25 -
36. CT104 gi|40807213 FAM179B protein 88.718 8,94 67 15 -
37. CT113 gi|25140644 Tyrosine hydroxylase isoform 1 14.144 9,52 70 27 - 38. CT120 gi|7447027 Glutamate/aspartate transporter II 61.745 6,20 88 26 ↓
39. CT123 gi|40786418 Profilin – 4 14.481 8,76 68 31 ↓
40. CT127 gi|25901054 SE2-5LT1 protein 89.926 6,31 81 11 -
41. CT134 gi|4139750 Chain A, Crystal Structure Of The Nfkb P50P65 HETERODIMER COMPLEXED To The Immunoglobulin Kb Dna
31.377 7,76 70 26 -
52