CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47
3.2.2. Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47
Sản phẩm PCR và vector pET22b+ sau khi cắt đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch (GeneJET PCR Purification Kit) và đƣ ợc dùng để gắn nối với nhau bằng enzyme T4 ligase nhằm tạo vector biểu hiện tái tổ hợp. Sau đó, sản phẩm gắn nối đƣợc biến nạp vào chủng tế bào khả biến E. coli DH5αbằng phương pháp sốc nhiệt.
Dịch tế bào sau biến nạp được cấy trải trên môi trường LB/agar bổ sung Amp 100 àg/ml. Sau khi ủ qua đờm ở 37oC, cỏc khuẩn lạc trắng mọc trờn đĩa thạch (Hình 3.3).
5493 bp
24
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại gen antiCD47) và vector pET22b+ vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp
sốc nhiệt. Tế bào đƣợc ủ ở 37oC qua đêm để quan sát rõ hình thái khuẩn lạc trắng.
Kết quả trên Hình 3.3 cho thấy các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường có kháng sinh ampicilin là do plasmid có mang gen kháng ampicilin. Hình thái của các khuẩn lạc trắng tròn đều, không bị nhiễm, chƣa có khuẩn lạc vệ tinh (do thời gian ủ thích hợp, các khuẩn lạc chưa kịp phân giải Ampicilin trong môi trường nên các khuẩn lạc vệ tinh chƣa kịp mọc). Điều này cho thấy quá trình gắn nối sản phẩm PCR đầu bằng vào vector pET-22b+ và quá trình biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt đã đƣợc chúng tôi thực hiện thành công.
Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc màu trắng mọc và phát triển đƣợc trên môi trường LB/agar có Amp đều mang plasmid tái tổ hợp chứa gen cần tách dòng mà còn có cả vector gốc pET-22b+ tự đóng vòng. Do đó chúng tôi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để sàng lọc đƣợc các khuẩn lạc thực sự có mang plasmid tái tổ hợp, đó là: tách chiết plasmid, kiểm tra plasmid bằng phương pháp PCR với mồi T7 promoter/T7 terminator.
Kiểm tra sơ bộ các dòng mang gen anti-CD47
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên môi trường kháng sinh chọn lọc để tách plasmid nhằm chọn đƣợc các dòng plasmid mang gen anti-CD47. Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên Hình 3.4.
25
Hình 3.4. Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47. Hình ảnh điện di so sánh kích thước của 5 dòng với vector gốc pET22b+. 1. vector gốc pET22b+, 2. plasmid
dòng 1, 3. Plasmid dòng 2, 4. Plasmid dòng 3, 5. Plasmid dòng 4, 6. plasmid dòng 5.
Do được gắn thêm gen anti-CD47 nên kích thước của vector tái tổ hợp lớn hơn kích thước của vector pET22b+ gốc.
Phân tích Kết quả điện di trên Hình 3.4 cho thấy ở các đường chạy 1,2,3 và 5 đều xuất hiện 2 băng đó là hai dạng cấu trúc cuả plasmid. Trong đó plasmid ở đường chạy số 1,3 và 5 sáng và rõ hơn có băng cao hơn plasmid gốc nên chúng đều có khả năng mang gen anti-CD47. Để khẳng định chắc chắn, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với khuôn là các dòng plasmid trên cùng với đối chứng là plasmid gốc với cặp mồi T7 promoter/T7 terminantor. Kết quả của phản ứng PCR đƣợc thể hiện trên Hình 3.5 dưới đây.
300 bp
26
Hình 3.5. Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi T7 promoter/T7 terminator, khuôn là plasmid gốc, plasmid dòng 1, 3 và 5. Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid gốc có kích thước khoảng 309 bp, sản phẩm PCR
của các dòng tái tổ hợp có kích thước khoảng 1300 bp. 1. plasmid gốc pET22b+, 2.
plasmid dòng số 1, 3. plasmid dòng số 3, 4. plasmid dòng số 5, 5. Marker 1 kb.
Cặp mồi T7 promoter/T7 terminator bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide từ vùng đầu đến vùng cuối của vùng MCS (vùng đa tách dòng) trên vector pET22b+. Do đó khi đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR, plasmid gốc đƣợc nhân băng kích thước khoảng 300 bp, plasmid tái tổ hợp được nhân băng kích thước khoảng 1300 kb. Kết quả điện di trên Hình 3.5 cho thấy các sản phẩm PCR có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết, các dòng plasmid 1, 3 và 5 đều là các dòng plasmid tái tổ hợp. Chúng tôi chọn dòng số 1 để giải trình tự gen.
Kết quả giải trình tự gen
Sử dụng cặp mồi T7 promoter/T7 terminator của vector để giải trình tự gen dòng số 1 thu đƣợc trình tự nucleotite và dịch mã trình tự này sang trình tự axit amin chúng tôi đƣợc kết quả nhƣ sau:
1 M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A 1 ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCG 21 M A M D I G I N S D P E E L Q V I Q P D 61 ATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGAC 41 K S V L V A A G E T A T L R C T A T S L 121 AAGTCCGTGTTGGTTGCAGCTGGAGAGACAGCCACTCTGCGCTGCACTGCGACCTCTCTG 61 I P V G P I Q W F R G A G P G R E L I Y 181 ATCCCTGTGGGGCCCATCCAGTGGTTCAGAGGAGCTGGACCAGGCCGGGAATTAATCTAC 81 N Q K E G H F P R V T T V S D L T K R N 241 AATCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGACCTCACAAAGAGAAAC 101 N M D F S I R I G N I T P A D A G T Y Y 301 AACATGGACTTTTCCATCCGCATCGGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTAC 121 C V K F R K G S P D D V E F K S G A G T 361 TGTGTGAAGTTCCGGAAAGGGAGCCCCGATGACGTGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACT 141 E L S V R A K P S A P V V S G P A A R A 421 GAGCTGTCTGTGCGCGCCAAACCCTCTGCCCCCGTGGTATCGGGCCCTGCGGCGAGGGCC 161 T P Q H T V S F T C E S H G F S P R D I 481 ACACCTCAGCACACAGTGAGCTTCACCTGCGAGTCCCACGGCTTCTCACCCAGAGACATC
27
181 T L K W F K N G N E L S D F Q T N V D P 541 ACCCTGAAATGGTTCAAAAATGGGAATGAGCTCTCAGACTTCCAGACCAACGTGGACCCC 201 V G E S V S Y S I H S T A K V V L T R E 601 GTAGGAGAGAGCGTGTCCTACAGCATCCACAGCACAGCCAAGGTGGTGCTGACCCGCGAG 221 D V H S Q V I C E V A H V T L Q G D P L 661 GACGTTCACTCTCAAGTCATCTGCGAGGTGGCCCACGTCACCTTGCAGGGGGACCCTCTT 241 R G T A N L S E T I R V P P T L E V T Q 721 CGTGGGACTGCCAACTTGTCTGAGACCATCCGAGTTCCACCCACCTTGGAGGTTACTCAA 261 Q P V R A E N Q V N V T C Q V R K F Y P 781 CAGCCCGTGAGGGCAGAGAACCAGGTGAATGTCACCTGCCAGGTGAGGAAGTTCTACCCC 281 Q R L Q L T W L E N G N V S R T E T A S 841 CAGAGACTACAGCTGACCTGGTTGGAGAATGGAAACGTGTCCCGGACAGAAACGGCCTCA 301 T V T E N K D G T Y N W M S W L L V N V 901 ACCGTTACAGAGAACAAGGATGGTACCTACAACTGGATGAGCTGGCTCCTGGTGAATGTA 321 S A H R D D V K L T C Q V E H D G Q P A 961 TCTGCCCACAGGGATGATGTGAAGCTCACCTGCCAGGTGGAGCATGACGGGCAGCCAGCG 341 V S K S H L E H H H H H H *
1021GTCAGCAAAAGCCATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
Hình 3.6. Trình tự nucleotide của gen mã hóa kháng thể anti-CD47 và trình tự axit amin của kháng thể anti-CD47. Trình tự axit đƣợc đánh dấu màu xanh lá cây là đuôi His-tag. Mã
mở đầu ATG và mã kết thúc TGA đƣợc đánh dấu màu đỏ.
Kết quả giải trình tự cho thấy dòng số 1 mang đúng trình tự gen mã hóa kháng thể anti-CD47 bao gồm 1059 nucleotide, có mã mở đầu ATG và mã kết thúc TGA . Sáu bộ ba mã hóa cho Histidine nằm trước mã kết thúc nên protein đích biểu hiện chứa đuôi His-tag thuận lợi cho việc phát hiện và tinh sạch. Đoạn gen mã hóa kháng thể anti-CD47 đƣợc gắn vào vector pET22b+ đúng chiều, đúng khung đọc và không có đột biến. Dịch mã từ trình tự nucleotide của gen mã hóa kháng thể anti- CD47 sang trình tự axit amin, chúng tôi thu đƣợc một protein có trình tự gồm 353 axit amin tương đương với khối lượng xấp xỉ 39 kDa đúng với kích thước của kháng thể anti-CD47 theo tính toán lý thuyết. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã thiết kế và tạo thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen mã hóa kháng thể anti-CD47.
28