Từ bảng 3.2 cho thấy:
Trong số 20 chủng vi khuấn lactic đã được phân lập:
- Có 15 chủng sinh khí và 5 chủng không sinh khí.
- Có 15 chủng lên men dị hình và 5 chủng lên men đồng hình.
- Có 6 chủng lên men hiếu khí, 6 chủng lên men kỵ khí tùy tiện và 8 chủng lên men kỵ khí.
- Có 12 chủng không có khả năng lên men malolactic và 8 chủng có khả năng lên men malolactic.
- Cả 20 chủng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính.
Từ những nhận xét trên chúng tôi chọn 8 chủng là NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 có khả năng lên men malolactic. Chúng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập đƣợc Tên
chủng
Sinh khí
Kiểu hình
lên men Kiểu hô hấp Phân giải
axít malic Hoạt tính catalaza
NT1 + Dị hình Hiếu khí - -
NT2 - Đồng hình Kỵ khí tùy tiện - -
NT3 + Dị hình Kỵ khí + -
NT4 + Dị hình Hiếu khí - -
NT5 + Dị hình Hiếu khí - -
NT6 + Dị hình Kỵ khí + -
NT7 - Đồng hình Kỵ khí - -
NT8 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + -
NT9 + Dị hình Kỵ khí + -
NT10 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + -
NT11 - Đồng hình Kỵ khí - -
NT12 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + -
NT13 - Đồng hình Kỵ khí - -
NT14 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + -
NT15 + Dị hình Hiếu khí - -
NT16 - Đồng hình Kỵ khí - -
NT17 + Dị hình Hiếu khí - -
NT18 + Dị hình Hiếu khí - -
NT19 + Dị hình Kỵ khí + -
NT20 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện - -
Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao.
Chúng tôi lấy 8 chủng đã chọn NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 cho nuôi cấy trong môi trường nước nho axít (AG), nhiệt độ nuôi cấy là 25oC.
Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao trong môi trường nước nho axít (AG) được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Chủng vi
khuấn
Hàm lƣợng axít malic (g/l) Hàm lƣợng axít lactic (g/l) Thời gian lên men
(ngày) Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men
NT3 2,15 0,81 0,3 1,38 29
NT6 2,15 0,39 0,3 1,39 31
NT8 2,15 0,92 0,3 1,05 26
NT9 2,15 0,28 0,3 1,56 24
NT10 2,15 0,49 0,3 1,37 40
NT12 2,15 0,20 0,3 1,61 23
NT14 2,15 1,01 0,3 1,01 28
NT19 2,15 1,29 0,3 0,98 36
Ghi chú:
- Nhiệt độ quá trình lên men malolactic: 25oC
- Thời gian kết thúc lên men khi hàm lượng axít malic của dịch lên men không thay đổi đáng kể trong 3 ngày cuối cùng liên tiếp.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy:
*Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT19 có khả năng phân giải axít malic thấp nhất với hàm lượng axít malic còn dư sau lên men là rất cao (1,29 g/l).
- Các chủng NT9 và NT12 có khả năng phân giải axít malic cao nhất với hàm lượng axít malic còn dư sau lên men rất thấp.
+ Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư sau lên men là (0,28 g/l).
+ Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư sau lên men là (0,20 g/l).
*Khả năng tạo ra Axít lactic:
- Chủng NT19 có khả năng tạo ra Axít lactic thấp nhất với hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là rất thấp (0,98g/l).
- Các chủng NT9 và NT12 có khả năng tạo ra Axít lactic cao nhất với hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dich sau lên men rất cao.
+ Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là (1,56 g/l).
+ Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo ra trong dịch sau lên men là (1,61 g/l).
*Thời gian lên men malolactic:
- Lâu nhất là chủng NT10 (40 ngày) - Chủng NT9 là (24 ngày)
- Ngắn nhất là chủng NT12 là (23 ngày)
Từ những nhận xét trên chúng tôi chọn chủng NT9 và NT12 vì có khả năng phân giải axít malic tốt nhất với hàm lượng axít malic còn dư trong dịch lên men thấp nhất chủng NT9 là 0,28 g/l, chủng NT12 là 0,20 g/l. Chủng NT9 và NT12 còn có khả năng lên men malolactic triệt để nhất trong thời gian ngắn từ 23 đến 24 ngày, được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 2 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được Để đánh giá khả năng chịu SO2 và khả năng chịu etanol của các chủng malolactic phân lập được chúng tôi tiến hành lên men 2 chủng vi khuấn malolactic là NT9 và NT12 trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5 100 mg/l và bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC.
Khả năng phân giải axít malic thành axít lactic sau quá trình lên men malolactic được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic và axít lactic trước và sau lên men Malolactic trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lƣợng K2S2O5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v
Chủng vi khuẩn malolactic
Axít malic (g/l) Axít lactic (g/l) Thời gian lên men
(ngày) Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men
NT9 2,15 1,45 0,3 0,8 30
NT12 2,15 0,14 0,3 1,68 25
Ghi chú: Nhiệt độ lên men 25oC trong thời gian từ 25 đến 30 ngày.
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:
Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (1,45 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,14 g/l).
Khả năng tạo ra Axít lactic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,8 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (1,68 g/l).
Thời gian lên men malolactic là - Lâu nhất là Chủng NT9 (30 ngày) - Chủng NT12 là (25 ngày)
Từ những nhận xét trên chúng tôi nhận thấy Chủng NT9 không có khả năng chịu SO2 và etanol nên quá trình lên men malolactic diễn ra không hoàn toàn. Hàm lượng axít malic còn lại rất cao, là 1,45 g/l sau 30 ngày lên men. Còn chủng vi khuẩn còn lại là NT12 có khả năng phân giải malic rất tốt trong điều kiện môi trường được sulphit hóa, có nồng độ cồn cao, thể hiện ở hàm lượng malic còn lại sau lên men là không đáng kể là 0,14 g/l và có thời gian lên men nhanh là 25 ngày.
3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trường rượu vang non
Rượu vang non lên men từ dịch nho như 2.2.1 bởi chủng nấm men S.
cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tổng số 5,39 g/l) được lên men malolactic bởi 2 chủng NT9, NT12 ở điều kiện nhiệt độ 25oC. Kết quả phân giải axít malic được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.1
Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Chủng vi khuấn
Axít malic (g/l)
Trước lên men Sau lên men
NT9 2,15 0,75
NT12 2,15 0,12
Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Kết quả trên bảng 3.5 và hình 3.1 cho thấy:
Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,75 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,12 g/l).
Bảng 3.6 Hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Chủng vi khuấn
Axít lactic (g/l)
Trước lên men Sau lên men
NT9 0,32 0,95
NT12 0,32 1,64
Hình 3.2. So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Kết quả trên bảng 3.6 và hình 3.2 cho thấy:
Khả năng tạo ra Axít lactic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men thấp là (0,95 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít lactic được tạo thành trong dịch sau lên men là (1,64 g/l).
Từ các nhận xét trên chúng tôi nhận thấy Chủng NT12 có khả năng phân giải axít malic tương đối tốt trên môi trường vang non. Khả năng phân giải axít malic Chủng NT12 có khả năng phân giải nhanh và mạnh hơn so với Chủng NT9, tạo ra axit lactic có hàm lượng rất cao là 1,64 g/l.
Dịch lên men của các chủng malolactic còn được phân tích thành phần axít axetic kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.3
Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Chủng vi khuấn Axít axetic (g/l)
Trước lên men Sau lên men
NT9 0,22 0,35
NT12 0,22 0,25
Kết quả trên bảng 3.7 và hình 3.3 cho thấy:
Khả năng tạo ra Axít axetic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít axetic được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,35 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít axetic được tạo thành trong dịch sau lên men thấp nhất là (0,25 g/l).
Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Dịch lên men của các chủng malolactic còn được phân tích thành phần diaxetyl kết quả trình bầy ở bảng 3.8 và hình 3.4
Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Chủng vi khuấn Diaxetyl (g/l)
Trước lên men Sau lên men
NT9 0,20 0,25
NT12 0,20 0,27
Hình 3.4 So sánh hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic
Kết quả trên bảng 3.8 và hình 3.4 cho thấy:
Khả năng tạo ra Diaxetyl
- Chủng NT12 hàm lượng Diaxetyl được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,27 g/l).
- Chủng NT9 hàm lượng Diaxetyl được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,25 g/l).
Chủng vi khuẩn NT12 có khả năng tạo ra hàm lượng axít axetic thấp (0,25 g/l) và tạo ra diaxetyl cao (0,27 mg/l). Diaxetyl là một chất quan trọng trong quá trình lên men malolactic. Đối với vang đỏ, hàm lượng của nó từ 0,2-0,4 mg/l sẽ đóng góp tích cực vào giá trị cảm quan của rượu.
Từ những nhận xét trên, có thể rút ra kết luận là chủng vi khuẩn NT12 của có một số ưu điểm hơn Chủng NT9. Đặc biệt, khả năng tạo diaxetyl không cao của Chủng NT12 là rất phù hợp cho sản xuất các loại rượu vang đỏ không có mùi bơ, ngậy.
3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic Ngoài khả năng khử axít L-malic thành axít L-lactic, lên men malolactic còn tác động tới sự cân bằng hương và vị của rượu vang thành phẩm do nó tạo ra nhiều chất thơm và bay hơi. Trong đó có diaxetyl là một trong những chất thơm quan trọng nhất của lên men malolactic đối với rượu vang thành phẩm. Ngay sau khi kết
thúc quá trình lên men rượu, vi khuẩn malolactic (Chủng NT9 và Chủng NT12) được cấy vào môi trường rượu vang non lên men từ dịch nho như 2.2.1 bởi chủng nấm men S.
cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tong số 5,39 g/l) được lên men malolactic bởi 2 chủng NT9 và Chủng NT12 ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tạo 2 mẫu thí nghiệm. Hàm lượng một số chất hay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic rượu vang non của các chủng là được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 02 chủng
Tên chủng
Axít axetic (mg/L)
Axít axetolactic
(mg/L)
Diaxetyl (mg/L)
2,3 Butanediol
(mg/L) Trước
MLF
Sau MLF
Trước MLF
Sau MLF
Trước MLF
Sau MLF
Trước MLF
Sau MLF
NT9 216 405 1,15 1,48 0,21 0,25 234 345
NT12 221 251 1,17 1,78 0,32 0,31 231 415
Hình 3.5 So sánh hàm lƣợng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng
Qua bảng 3.9 và Hình 3.5 cho thấy khả năng tạo thành các chất bay hơi của 2 chủng là tương đối khác nhau sau quá trình lên men malolactic. Chủng NT9 là
chủng tạo ra nhiều axít bay hơi axêtic không mong muốn (405mg/L), Chủng NT12 là chủng tạo ra nhiều cấc chất bay hơi mong muốn như axít axêtolactic là 1,78mg/L, diaxêlyl là 0,32mg/L và 2,3 butanediol là 415 mg/L). Theo Jan Clair Nielsen và Marianne Richelieu, 1999, trong nghiên cứu kiểm soát sự phát triển của hương thơm rượu vang trong và sau quá trình lên men malolactic bởi O.oeni đã cho thấy hàm lượng các chất thơm của rượu vang như axít axetic là 320g/L, axít axctolactic là 1,8mg/L, diaxetyl chỉ là 0,07mg/L và 2,3 butandiol là 420mg/L [37]. Diaxetyl là một trong những chất bay hơi quan trọng nhất cua lên men malolactic. Diaxetyl tạo ra cho rượu vang mùi thơm đặc trưng của bơ hoặc lạc. Trong quá trình lên men malolactic, axít axetolactic, diaxetyl và axetoin đều là sản phẩm trung gian của sự phân huỷ axít citric thành 2,3 butandiol. Các tác giả này cũng cho thấy hàm lượng axít L-malic và citric của rượu vang sau quá trình lên men malolactic tương ứng là 0,01g/L và l0 mg/L. Trước đó, Martineau và cộng sự, 1995, đã chỉ ra rằng ngưỡng cảm nhận được mùi thơm của diaxetyl thay đổi từ 0,2mg/L trong rượu vang Chardonnay tới 0,9mg/L trong rượu vang Pinot noir và 2,8mg/L trong rượu vang Cabemet Sauvignon.
Từ các nhận xét trên chúng tôi chọn Chủng NT12 cho các nghiên cứu tiếp theo vì Chủng NT12 có 1 số đặc tính sau.
- Khả năng chịu SO2 là tốt nhất trong các chủng phân lập được: K2S2O5 100mg/l - Khả năng lên men malolactic trên môi trường rượu vang non là tốt nhất trong các chủng phân lập được.
- Khả năng tạo chất thơm tốt nhất trong trong các chủng phân lập được.
3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic O.oeni NT12
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic
Tính chất của rượu vang non được trình bày trong bảng 3.10 như 2.2.1 syrô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá trình này tiếp tục lên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non.
Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rƣợu
TT Thành phần Đơn vị Hàm lƣợng
1 Etanol % v/v 12,8
2 pH 3,4
3 Axít tổng số g/l H2SO4 5,39
4 Axít bay hơi (axít axetic) g/l 0,23
5 Đường sót g/l 5,2
6 Tỷ trọng 0,981
7 SO2 tổng số g/l 35
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, kết thúc quá trình lên men rượu, thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường rất nghèo nàn, chứng tỏ quá trình lên men kiệt.
Đối với vi khuẩn lactic, các yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hiệu quả và tốc độ của quá trình lên men là pH, nồng độ etanol, nồng độ SO2 và nhiệt độ. Các yếu tố này không chỉ tác động riêng rẽ mà còn có tác động hiệp lực. Chủng NT12 có khả năng lên men được trên môi trường rượu vang non như ở mục 2.2.1 từ chủng nấm men S. cerevisiae SH09 không chỉ có nồng độ ethanol và SO2 cao mà pH còn rất thấp (3,4). Ngoài ra trong dịch rượu vang còn rất nghèo dinh dưỡng (đường sót 5,2 g/l), hàm lượng axít tổng số cao đáng kể (5,39 g/l H2SO4). Dưới điều kiện lên men khắc nghiệt như vậy, việc bổ sung các chất dinh dưỡng vào dịch lên men giúp cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn lactic là rất cần thiết vì vi khuẩn lactic không thể dự trữ hoặc tổng hợp được tất cả các axít amin quan trọng. Để làm rõ tác dụng này, thí nghiệm đã được tiến hành lên men malolactic trên 3 mẫu sử dụng chất dinh dưỡng bổ sung (chế phẩm Essentials Oenos) và 01 mẫu đối chứng. Nhiệt độ lên men được ổn định ở 25oC. Kết quả phân giải axít malic sau quá trình lên men malolactic ở các mẫu được minh họa ở bảng 3.11 và hình 3.6
Bảng 3.11 Hàm lƣợng axít malic (g/l) đƣợc phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác nhau theo thời gian
Ngày
Nồng độ EO
0 5 10 15 20 25
0 g/l 2,15 1,8 1,6 1,2 0,8 0,55
0,025 g/l 2,15 1,7 1,4 1 0,12 0,1
0,05 g/l 2,15 1,6 1,3 0,9 0,12 0,1
0,075 g/l 2,15 1,5 1,25 0,86 0,12 0,1 Ghi chú: Mẫu 0 mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos
Mẫu có bổ sung Essentials Oenos (EO)
Hình 3.6 Hàm lƣợng axít malic đƣợc phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác nhau theo thời gian.
Kết quả minh họa ở bảng 3.11 và hình 3.6 cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos và các mẫu thí nghiệm bổ sung Essentials Oenos về cả khả năng phân giải axít malic và thời gian lên men. Ớ mẫu đối chứng, trong điều kiện dịch vang non không bổ sung dinh dưỡng, hàm
lượng axít malic ở ngày thứ 25 vẫn còn là 0,55 g/l, chứng tỏ quá trình lên men malolactic chưa hoàn thành. Tiếp tục cho mẫu này lên men trong 3 ngày tiếp theo nhưng hàm lượng axít malic giảm xuống không đáng kể, chỉ là 0,52 g/l (số liệu không trình bày). Trong khi đó, ở cả 3 mẫu bổ sung Essentials Oenos, quá trình lên men malolactic đều kết thúc ở 20 ngày, với hàm lượng axít malic còn lại rất thấp, là 0,12 g/l. Sự khác nhau giữa 3 mẫu này chỉ thể hiện là ở hai mẫu có nồng độ Essentials Oenos cao hơn (0,05 và 0,075 g/l) thì sự khởi động của vi khuẩn lactic trong những ngày đầu nhanh hơn nhưng cũng phải cần đến 20 ngày thì sự phân giải axít malic mới gần như cạn kiệt (0,12 g/l). Vì vậy, có thể lựa chọn nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là 0,025 g/l để bổ sung cho quá trình lên men malolactic.
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic
Theo Henick - Kling và nhiều tác giả, quá trình lên men malolactic không chỉ đơn thuần là một quá trình chuyển axít malic thành axít lactic mà nó còn có ảnh hưởng lớn đển chất lượng cảm quan của rượu vang. Chất lượng cảm quan của rượu cao hay thấp không chỉ phụ thuộc vào quá trình lên men rượu mà phụ thuộc rất nhiều vào quá trình lên men malolactic, trong đó phải kể đến các yếu tố chủng vi khuấn lựa chọn, điều kiện của quá trình lên men [33]. Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tiến trình lên men malolactic. Tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu lên men malolactic bổ sung vi khuẩn lactic tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả về thời gian lên men malolactic cũng như sự hình thành một số tính chất quan trọng của rượu vang được trình bày ở bảng 3.12
Kết quả bảng 3.12 cho thấy lên men malolactic ở nhiệt độ 15°C là không phù hợp bởi vì sau 45 ngày lên men, hàm lượng axít malic còn lại khá nhiều ở rượu vang (1,45 g/l). Số lượng quần thể vi khuẩn malolactic đạt được ngay từ đầu quá trình lên men có ý nghĩa quan trọng đối với lên men malolactic. Nhiệt độ thấp 15°C đã không thúc đẩy được sự phát triển của vi khuẩn và do vậy không đủ sinh khối tạo enzym chuyển hóa axít malic thành axít lactic.