Chỉ thị sinh học để đánh giá tình trạng stress oxi hóa trong cơ hể là cần thiết để chẩn đoán bệnh, kiểm tra sức khỏe, phát triển thuốc an toàn và đánh giá hiệu quả của các loại thuốc, thực phẩm, đồ uống và các chất bổ sung [53].
Do ROS có thể đồng thời tấn công lipid, protein và axit nucleic trong các tế bào sống, gây tổn thương DNA, lipid, và protein và tạo ra các sản phẩm đặc trưng (hình 1.6). Vì vậy, việc đo lường chính xác và đáng tin cậy về tổn thương oxi hóa lipid, protein và DNA thông qua các sản phẩm oxi hóa là quan trọng trong việc đánh giá mức độ thiệt hại mà ROS gây ra.
21
Hình 1.6: Các chỉ thị sinh học của stress oxi hóa thông qua các sản phẩm oxi hóa các phân tử sinh học [16]
Các chỉ thị đáng tin cậy của stress oxi hóa được sử dụng phổ biến là:
- Chỉ thị của stress oxi hóa DNA: 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) là sản phẩm của tổn thương oxi hóa nucleoside của DNA phổ biến nhất được phát hiện và nghiên cứu [47].
- Chỉ thị của stress oxi hóa protein: cacbonyl protein là một chỉ thị sinh học của oxi hóa protein [57] – được tạo thành tử carbonyl hóa Pro, Arg, Lys và Thr - sản phẩm phổ biến nhất của oxi hóa protein
- Chỉ thị của stress oxi hóa lipid: Các sản phẩm peroxi hóa lipid được coi là chỉ thị sinh học tiềm năng. Các chỉ thị sinh học thường được sử dụng là Malondial dehyde – MDA (sản phẩm thứ cấp của peroxi hóa lipid chứa các axit béo axit béo ω3 và axit béo ω6 có nhiều liên kết đôi), 4- HNE và IsoProstanes (hình thành từ peroxi hóa lipid axit béo không bão hòa là arachidonic (20:4)), Oxysterols (hình thành từ oxi hóa cholesterol) [34,58]. Trong đó (MDA) là chỉ thị sinh học phổ biến của quá trình peroxi hóa lipid [53,57,80]
Các ROS gây peroxi hóa lipid đóng một vai trò quan trọng trong quá trình bệnh lý. Gần đây, vai trò sinh học của sản phẩm peroxi lipid đã nhận được rất nhiều sự chú ý không chỉ trong việc làm sáng tỏ cơ chế bệnh lý mà còn cho các ứng dụng thực tế lâm sàng như là chỉ thị sinh học [80].
22 1.5.2. Chỉ thị sinh học MDA
MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxi hóa lipid được quan tâm nghiên cứu hàng đầu hiện nay. MDA là chỉ thị của tổn thương oxi hóa ở các tế bào và mô. MDA cũng được sử dụng như một chỉ thị của tổn thương màng tế bào [54].
MDA có tính axit yếu, pKa = 4.46.
Công thức phân tử: C3H4O2
Công thức cấu tạo:
Khối lượng phân tử tương đối: 72.07 g.mol-1 Tính ổn định: Ổn định dưới điều kiện trung tính.
MDA hấp thụ trong vùng tử ngoại với dung môi là nước. MDA hấp thụ cực đại ở bước sóng 245 nm với hằng số hấp thụ điện tử ε = 13.103(cm-1.M-1) ở môi trường acid, còn trong môi trường kiềm chúng hấp thụ cực đại ở 267 nm với ε = 30.103 (cm-1.M-1) [42].
1.5.2.1. MDA – sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxi hóa lipid
Sự peroxi hóa lipid hay nói cách khác là phản ứng của oxi với lipid không bão hòa tạo ra một lượng lớn các sản phẩm oxi hóa. Sản phẩm chính của quá trình là sự hình thành nên gốc lipid hydroperoxide (LOOH). Các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxi hóa lipid là các loại aldehydes như là MDA, propanal, hexanal, và 4-hydroxinonenal (4-HNE)[4]. MDA được hình thành chủ yếu trong quá trình peroxide hóa lipid của các lipid có chứa các gốc PUFA, tuy nhiên cơ chế chi tiết cho quá trình này vẫn chưa được rõ ràng. Có hai giả thiết chính về cơ chế hình thành MDA, cơ chế thứ nhất do Dahle và cộng sự cho rằng MDA được hình thành từ các gốc tự do peroxyl của các PUFA (có từ 3 nối đôi liên hợp trở lên) bằng quá trình đóng vòng đơn giữa các nguyên tử oxi của các peroxide, cơ chế thứ hai do Pryor và cộng sự cho rằng MDA được hình thành từ các gốc tự do dị vòng chứa gốc -O-O- của các PUFA bằng quá trình đóng vòng đôi [52]. Ngoài ra, một lượng
23
nhỏ MDA có thể được hình thành từ sự oxi hóa acid arachidonic và quá trình thoái hóa oxi hóa phụ thuộc sắt của amino acid, carbonhydrate, đường pentose và hexose [52].
1.5.2.2. Các phương pháp định lượng MDA
Để định lượng MDA có thể sử dụng các phương pháp định lượng trực tiếp hoặc định lượng thông qua các dẫn xuất của MDA với các chất khác (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Các phương pháp định lượng MDA [42]
Loại phương pháp Chất phân tích Cách phân tách hoặc
thu nhận chất Cách phát hiện, định lƣợng
Định lƣợng trực tiếp
MDA
Sắc kí lọc gel Đo quang phổ UV Chưng cất bằng hơi
nước sau đó dùng sắc kí pha đảo HPLC
Siêu lọc sau đó dùng sắc kí lọc gel HPLC
Sắc kí ái lực ion HPLC Siêu lọc sau đó dùng sắc kí ái lực ion HPLC Định
lƣợng thông qua dẫn xuất
Chất huỳnh quang
1-Amino-3-imino-
propenes Chiết bằng dung môi Đo quang phổ huỳnh quang 1-Dansyl-pyrazole Chiết bằng dung môi sau
đó dùng sắc kí thường HPLC
Đo quang phổ huỳnh quang MDA-dianils Chiết bằng dung môi Đo quang
phổ huỳnh quang Sản phẩm cộng
MDA và TBA
Chiết bằng dung môi Đo quang phổ
huỳnh quang Sắc kí thường HPLC
Sắc kí pha đảo HPLC Chiết bằng dung môi rồi dùng sắc kí ái lực HPLC
Chất Dibenzanthrone Không dùng Đo quang
24
màu phổ khả
kiến Sản phẩm cộng
MDA và TBA
Không dùng Đo quang
phổ khả kiến Chiết bằng dung môi
Sắc kí bản mỏng Sắc kí cột lọc gel
Chiết bằng dung môi rồi dùng sắc kí pha đảo HPLC
Sắc kí ái lực ion HPLC Sắc kí pha đảo HPLC 1-Methylpyrazole Chiết bằng dung môi rồi
dùng sắc kí khí Detector Nitro- phosph Các chất
dễ bay hơi
2-(Pyrazol-1‟-yl)-
benzothiazole Detector
Nitro- phosph MDA-pentafluoro-
phenylhydrazine Detector
Electron- capture Các phương pháp phân tích định lượng MDA trực tiếp đều dựa trên nguyên lý kết hợp HPLC với đo quang phổ tử ngoại. Phương pháp định lượng trực tiếp cho độ nhạy và đặc hiệu cao tuy nhiên cũng có những hạn chế và khó khăn về kĩ thuật.
Phương pháp đòi hỏi các thiết bị HPLC với detector có độ nhạy cao, thời gian chạy sắc ký để thôi MDA cùng các thành phần khác của mẫu lớn, tùy thuộc vào mỗi loại mẫu, thời gian có thể rất khác nhau. Thêm vào đó MDA cũng có thể liên kết với các thành phần của mẫu, khi đó cần phải thủy phân các liên kết này trước khi chạy HPLC đồng phải phân tích xem lượng MDA liên kết là bao nhiêu để có thể định lượng đúng giữa MDA tổng số và MDA tự do [42].
Các phương pháp định lượng MDA thông qua dẫn xuất cho phép định lượng gián tiếp MDA bằng cách định lượng các dẫn xuất có khả năng phát huỳnh quang, các dẫn xuất màu, các dẫn xuất hấp thụ tia tử ngoại hay các sản phẩm khí. Các phản ứng tạo dẫn xuất của MDA đòi hỏi phải thực hiện trong các điều kiện khắc nghiệt (môi trường acid, nhiệt độ cao, có các dung môi hữu cơ), điều này khiến cho mẫu có thể bị oxi hóa hay phân hủy tạo ra các dẫn xuất phụ hoặc các sản phẩm không mong
25
muốn gây nhiễu đến việc định lượng. So với các phương pháp định lượng trực tiếp, các phương pháp định lượng thông qua dẫn xuất có thể dẫn đến các đánh giá sai lệch về chỉ số peroxyl hóa lipid MDA nhiều hơn. Tuy nhiên, các phương pháp định lượng thông qua dẫn xuất vẫn đang được dùng để đánh giá MDA tạo ra từ quá trình peroxyl hóa lipid bởi tính dễ thực hiện, năng suất lớn, có thể xử lý đồng thời được nhiều mẫu với tốc độ nhanh chóng, có thể định lượng bằng phương pháp quang phổ. Để giảm thiểu các ảnh hưởng của các dẫn xuất phụ đến kết quả, HPLC thường được kết hợp để phân tách hỗn hợp các dẫn xuất. Ngoài ra, việc tiến hành phản ứng trong điều kiện kị khí kết hợp với bổ sung các chất chống oxi hóa như butyllated hydroxyltoluene (BHT) đã được đề nghị để giúp giảm thiểu quá trình tự oxi hóa hay phân hủy của mẫu trong quá trình tạo dẫn xuất. Tuy nhiên có rất ít các nghiên cứu trực tiếp chứng minh sự hiệu quả của các biện pháp phòng ngừa trên. Phần lớn các phương pháp định lượng MDA thông qua dẫn xuất có liên hệ với Test TBA (Bảng 1.2) [42]. Test TBA là một trong các phương pháp phổ biến nhất để định lượng MDA thông qua phức MDA (TBA)2. Phương pháp này đánh giá chính xác lượng MDA hơn nhiều so với việc dùng dải bước sóng tử ngoại để do trực tiếp nó do không chỉ có riêng MDA mà rất nhiều các aldehyde khác có khối lượng phân tử nhỏ cũng hấp thụ ở dải bước sóng này. Sản phẩm cộng của phản ứng này là MDA(TBA)2. Phức này khá ổn định, hấp thụ cực đại trong bước sóng 535 nm, với hệ số hấp thụ điện tử ε = 1,56.105 (cm-1.M-1) [52].