Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế giới đã phát triển nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in vitro cho kết quả chính xác cao và thời gian thực hiện tương đối ngắn. Ở phần tiếp theo, chúng tôi sẽ đề cập đến những phép thử phổ biến nhất.
1.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro:
Có nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro. Có thể phân loại các phương pháp này bằng kỹ thuật đưa chất thử vào hệ thử [5].
Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc:
Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được tẩm vào khoanh giấy, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng chất. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc:
Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của chất nghiên cứu được cho vào ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 1.2 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro (a) Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc; (b) Phương pháp dùng ống
trụ trên môi trường đặc; (c) Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng;
(d)Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng:
Nguyên tắc của phương pháp là dùng hang loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu.
Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu ức chế được sự phát triển của
vi khuẩn. Nồng độ này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: minimal inhibitory concentration). Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp hoặc phương pháp hệ nồng độ.
Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtitre technique)
Phương pháp này, về nguyên tắc, chủ yếu cũng như phương pháp hòa loãng 2 lần liên tiếp, nhưng phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với phương pháp hệ nồng độ thông thường ở chỗ:
• Kỹ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm.
• Kỹ thuật thông thường dùng 6-8 độ pha loãng khác nhau của chất thử còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng.
• Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể cho thêm chỉ thị TTC), nhưng ở đây, được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA.
Phương pháp sinh tự ký ( Bioautography)
Hình 1.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro sinh ký tự
Phương pháp này sử dụng khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu này có tác dụng.
Nguyên tắc tương tự như các phương pháp sử dụng môi trường đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản mỏng, tiến hành láng môi trường thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18-24h để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc được; đó là chất có tác dụng kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl tetrazolium Chloride) 1.4.2 Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
Phương pháp MTT:
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào.
. Tetrazolium (màu vàng) Formaran (màu tím)
Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lờn proteiná SRB nhuộm bằng cỏch phỏ vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm.
Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
1.4.3. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của chất:
Oxy không thể thiếu với sự sống, khi đi vào cơ thể, oxy tham gia nhiều quá trình sinh hóa học. Trong quá trình đó, chúng tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là gốc tự do. Các gốc này có thể gây hại cho sức khỏe, do đó trong cơ thể cần thiết duy trì sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa. Đó là trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi. Tuy nhiên, do nhiều tác động, cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng dạng oxy hoạt động. Vì vậy việc bổ sung vào cơ thể các dạng chất chống oxy hóa là cần thiết.
Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất, hiện nay có một số phương pháp sau:
Phương pháp sử dụng DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước song λ = 517nm.
Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II
Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện
qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II và 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II).
Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2*-
Nguyên tắc: Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu thông qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O2*-
. Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolim (NBT) cho phức chất có màu tím được đo ở bước song λ = 550nm. Hoạt tính của mẫu thử được thể hiện qua việc giảm sự hình thành phức màu tím.
Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2
Nguyên tắc: Hai tiểu phân O2*- và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại trong cơ thể nhưng nếu hiện điện ở nồng độ cao chúng sẽ tạo ra 1O2 ,*OH là phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol (màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase ).