2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu bèo tây đƣợc lấy tại hồ khu vực Bắc Linh Đàm, quận Hoàng Mai, Hà Nội. Sau khi rửa sạch bèo tây, cắt bỏ phần rễ, sau đó đƣợc sấy bằng tủ sấy đến khối lƣợng không đổi.
- Đề tài sử dụng loại khuẩn Klebsiella oxytoca THLC0109 do thạc sĩ Trần Đăng Thuần phân lập từ quá trình ủ phân cừu và cỏ Napier khô tại Đài Loan.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tiền xử lý
- Bèo tây đƣợc sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 700C đến khối lƣợng không đổi, sau đó đƣợc cắt ngắn khoảng 2-3 cm và nghiền nhỏ bằng máy nghiền thành dạng bột. Bột bèo đƣợc bảo quản trong hộp kín, tránh bị ẩm mốc.
2.2.2. Phương pháp thủy phân
Bèo tây đƣợc thủy phân trong 120ml dung dịch axit H2SO4 loãng 2,5%, sau đó đun ở 1000C bằng máy điều nhiệt trong 35 phút. Làm lạnh đƣa về nhiệt độ phòng, trung hòa dung dịch sau thủy phân bằng NaOH sau đó lọc bằng giấy lọc băng xanh. Xác định hàm lượng đường khử của dung dịch thu được bằng phương pháp so màu.
Trong quá trình thủy phân, mục tiêu của đề tài là tìm ra đƣợc các thông số tối ưu có ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm thủy phân bèo tây: thời gian, nồng độ axit, tỷ lệ rắn lỏng.
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Xác định đường khử bằng phương pháp axit dinitro-salicylic (DNS)
- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS). Ban đầu dung dịch axit dinitro – salicylic (DNS) có màu vàng nhạt, sau khi phản ứng với đường khử chuyển sang màu da cam – đỏ đậm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Tiến hành so màu ở bước sóng 550nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn của D-glucose với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS axit:
2.2.4. Phương pháp lên men
Nhân giống vi khuẩn lên men:
Môi trường nhân giống gồm (pepton 5g/l; NaCl 5g/l). Lấy 100ml dung dịch môi trường nhân giống đưa vào bình thủy tinh có nút cao su. Khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 60-700C trong 15 phút.
Cấy vi sinh vật vào dung dịch: Công việc đƣợc tiến hành trong tủ khuấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến vi khuẩn và quá trình lên men sau này. Dùng que cấy vòng và đƣợc vô khuẩn trên đèn cồn chấm vào lọ đựng vi sinh vật sau đó từ từ đƣa vào bình thủy tinh chứa dung dịch môi trường nhân giống. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 24h.
Lên men mẫu:
Lấy 100ml dung dịch nước lọc bèo của quá trình thủy phân cho vào bình có nút cao su. Khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 60-700C trong 60 phút.
Sử dụng kim tiêm lấy 1ml dung dịch từ bình nuôi cấy cho vào bình lên men.
Nuôi ở nhiệt độ phòng. Cứ 24h tiến hành lấy mẫu 1 lần, mỗi lần lấy 6ml.
2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng Etanol
Dung dịch sau khi lên men đƣợc phân tích hàm lƣợng Etanol trên máy sắc khí GC tại phòng thí nghiệm của Khoa Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
Thiết bị sử dụng phân tích Etanol là máy sắc ký khí Detector cộng kết điện tử GC-ECD 2010 của hãng Shimazhu, Nhật Bản.
Điều kiện phân tích đã lựa chọn:
- Cột mao quản chiều dài 30m, đường kính trong 0,25 mm;
- Nhiệt độ cổng bơm mẫu: 1200C;
- Nhiệt độ detector ECD: 2800C;
- Khí mang N2 tốc độ dòng 1ml/phút;
- Phương pháp bơm mẫu Splitless
- Chương trình nhiệt độ cột: Nhiệt độ ban đầu là 1200C (giữ trong 1 phút), sau đó tăng lên 1500C với tốc độ 100C/phút và giữ ở 1500C trong 4 phút.
- Tổng thời gian chạy mẫu là 8 phút.
- Bơm mẫu theo kiểu heat-spray: Gồm 3 bước theo thứ tự (1), (2) và (3):
Mẫu ban đầu (1) đƣợc gia nhiệt đến trạng thái bão hòa (2), sau đó hút nhƣ ở (3) và bơm vào cổng bơm mẫu của máy sắc ký khí.
(1) (2) (3)