Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Bố trí thí nghiệm
Kế thừa từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Trúc Loan, Phan Thị Loan (2018), tiến hành tiền xử lý vỏ tôm như sau: Vỏ tôm tươi rửa sạch, sau đó đem đi sấy khô ở nhiệt độ 50-600C trong 6h, nghiền nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ thường.
2.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến giai đoạn thủy phân protein bằng dung dịch NaOH
Chất lượng của chitin-chitosan phụ thuộc rất lớn vào công đoạn thủy phân protein, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là nồng độ NaOH sử dụng, thời gian, nhiệt độ và tỉ lệ nguyên liệu / dung dịch NaOH.
Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Trúc Loan, Phan Thị Loan (2018) thì hiệu suất thủy phân protein đạt giá trị lớn nhất khi thực hiện trong dung dịch NaOH 0,8M trong thời gian 60 phút. Kế thừa kết quả từ nghiên cứu trước nên chúng tôi tiếp tục khảo sát 2 yếu tố còn lại là nhiệt độ và tỉ lệ nguyên liệu / dung dịch NaOH.
Dựa vào các điều kiện thủy phân protein của Kader Tokatli và các cộng sự [13], tiến hành bố trí các thí nghiệm. Cân 1g mẫu được tiền xử lý đưa đi thủy phân bằng dung dịch NaOH với các điều kiện sau:
- Nồng độ dung dịch NaOH: 0,8M.
- Thời gian thủy phân: 60 phút.
- Nhiệt độ thủy phân: 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC.
- Tỉ lệ vỏ tôm / dung dịch NaOH: 1/5, 1/10, 1/15.
Sau khi thủy phân mẫu được đem lấy ra, đem đi lọc rửa đến môi trường trung tính, dịch lọc được giữ lại và đem đi xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mục tiêu là hiệu suất thủy phân protein đạt giá trị lớn nhất.
2.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân protein.
Bố trí các thí nghiệm với các điều kiện sau:
- Nồng độ NaOH: 0,8M.
- Thời gian: 60 phút
- Tỷ lệ vỏ tôm/dung dịch NaOH: 1/10 (g/ml)
- Nhiệt độ thủy phân: 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC.
2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung dịch NaOH đến hiệu suất thủy phân protein.
Bố trí các thí nghiệm với các điều kiện sau:
- Nồng độ NaOH: 0,8M - Thời gian thủy phân: 60 phút
- Nhiệt độ thủy phân: được xác định ở mục 2.3.1.1 - Tỷ lệ vỏ tôm / dung dịch NaOH: 1/5, 1/10, 1/15.
2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến giai đoạn deacetyl hóa
Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Trúc Loan, Phan Thị Loan (2018) thì điều kiện khử khoáng tốt nhất là: Nồng độ EDTA 0,3M, thời gian 2 giờ, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 (g/ml), nhiệt độ phòng.
Sau quá trình loại bỏ protein và khử khoáng thu nhận chitin, ta cần deacetyl hóa để thu nhận chitosan. Trong giai đoạn deacetyl hóa này, yếu tố nồng độ dung dịch NaOH, thời gian, tỷ lệ vỏ tôm / dung dịch NaOH, thời gian và nhiệt độ phản ứng là những yếu tố quan trọng. Dựa vào các điều kiện của Kader Tokatli và các cộng sự (2017) [13] bố trí thí nghiệm như sau: Mẫu sau quá trình loại bỏ protein và khử khoáng được lọc rửa đến môi trường trung tính, đem đi sấy khô, cân chính xác khối lượng rồi đem đi deacetyl hóa bằng dung dịch NaOH với các điều kiện:
- Nồng độ dung dịch NaOH: 35%, 40%, 45%, 50%, 55%.
- Thời gian: 4h, 5h, 6h, 7h.
- Nhiệt độ : 80oC, 90oC, 100oC, 110oC, 120oC.
- Tỉ lệ vỏ tôm/dung dịch NaOH: 1/10, 1/15, 1/20.
Sau khi deacetyl, mẫu được lấy ra đem đi lọc, rửa đến môi trường trung tính, loại bỏ phần dịch lọc, phần rắn còn lại được sấy khô, cân và đem đi xác định độ deacetyl hóa của chitosan.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mục tiêu là độ deacetyl đạt giá trị lớn nhất.
2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl hóa của chitosan.
Bố trí các thí nghiệm với các điều kiện sau:
- Nhiệt độ phản ứng: 80oC
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH: 1/15 g/ml - Thời gian phản ứng: 6 giờ
- Nồng độ NaOH: 35%, 40%, 45%, 50%, 55%.
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH đến độ deacetyl hóa của chitosan.
Bố trí các thí nghiệm với các điều kiện sau:
- Nhiệt độ phản ứng: 80oC - Thời gian phản ứng: 6 giờ
- Nồng độ NaOH: đã xác định ở mục 2.3.2.1
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH: 1/10, 1/15, 1/20 g/ml.
2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ deacetyl hóa của chitosan.
Bố trí các thí nghiệm với các điều kiện sau:
- Thời gian phản ứng: 6 giờ
- Nồng độ NaOH: đã xác định ở mục 2.3.2.1
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH: đã xác định ở mục 2.3.2.2 - Nhiệt độ phản ứng: 80oC, 90oC, 100oC, 110oC, 120oC.
2.3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến độ deacetyl hóa của chitosan.
Bố trí các thí nghiệm với các điều kiện sau:
- Nồng độ NaOH: đã xác định ở mục 2.3.2.1
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch NaOH: đã xác định ở mục 2.3.2.2 - Nhiệt độ phản ứng: đã xác định ở mục 2.3.2.3
- Thời gian phản ứng: 4h, 5h, 6h, 7h.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thu nhận chitin-chitosan 2.3.3.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein
Quá trình khử protein được nghiên cứu bằng các thí nghiệm đơn lẻ với các điều kiện tối ưu theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Trúc Loan, Phan Thị Loan (2018) và được xác định ở mục 2.3.1 như sau: nồng độ NaOH 0,8M, nhiệt độ 60oC, thời gian 60 phút, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 10/1 (ml/g). Mẫu được tiền xử lý đưa đi thủy phân bằng dung dịch NaOH. Sau khi thủy phân mẫu được lấy ra, đem đi lọc rửa đến môi trường trung tính, dịch lọc được giữ lại và đem đi xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2. 1. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập của quá trình khử protein
Biến thực -α Mức dưới (-1)
Mức cơ sở (0)
Mức trên
(+1) +α
X1 0,7 0,75 0,8 0,85 0,9
X2 50 55 60 65 70
X3 6/1 8/1 10/1 12/1 14/1
X4 30 45 60 75 90
Ghi chú: = 2, Umax, Umin là giá trị cận trên (+1) và cận dưới (-1) của biến độc lập, U0= (Umin+ Umax)/2 là giá trị trung bình của cận trên và cận dưới.
Trong đó: X1 là nồng độ NaOH (M), X2 là nhiệt độ (oC), X3 là tỉ lệ dung môi/
nguyên liệu (ml/g), X4 là thời gian (phút).
2.3.3.2. Tối ưu hóa quá trình khử khoáng
Các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Trúc Loan, Phan Thị Loan (2018) như sau: nồng độ EDTA 0,3M, thời gian 120 phút, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 10/1 (ml/g). Mẫu sau khi khử protein bằng NaOH ở điều kiện tối ưu ở mục 2.3.4.1 được rửa đến môi trường trung tính, đem đi sấy khô, cân chính xác khối lượng rồi đem đi khử khoáng bằng dung dịch EDTA. Sau khi khử khoáng, mẫu được lấy ra đem đi lọc, rửa đến môi trường trung tính, loại bỏ phần dịch lọc, phần rắn còn lại được sấy khô, cân và đem đi xác định hàm lượng khoáng còn lại.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2. 2. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập của quá trình khử khoáng
Tên biến -α Mức dưới
(-1)
Mức cơ sở (0)
Mức trên
(+1) +α
X1 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
X2 6/1 8/1 10/1 12/1 14/1
X3 60 90 120 150 180
Ghi chú: = 2, Umax, Umin là giá trị cận trên (+1) và cận dưới (-1) của biến độc lập, U0= (Umin+ Umax)/2 là giá trị trung bình của cận trên và cận dưới.
Trong đó: X1 là nồng độ EDTA (M), X2 là tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu (ml/g), X3 làthời gian (phút).
2.3.3.3. Tối ưu hóa quá trình deacetyl hóa
Quá trình deacetyl hóa được nghiên cứu bằng các thí nghiệm đơn lẻ với các điều kiện tối ưu được xác định ở mục 3.3 như sau: nồng độ NaOH 45%, nhiệt độ 110oC, thời gian 5 giờ. Mẫu sau quá trình loại bỏ protein và khử khoáng được lọc rửa đến môi trường trung tính, đem đi sấy khô, cân chính xác khối lượng rồi đem đi
deacetyl hóa bằng dung dịch NaOH. Sau khi deacetyl, mẫu được lấy ra đem đi lọc, rửa đến môi trường trung tính, loại bỏ phần dịch lọc, phần rắn còn lại được sấy khô, cân và đem đi xác định độ deacetyl hóa.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Bảng 2. 3. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập của quá trình deacetyl hóa
Tên biến -α Mức dưới
(-1)
Mức cơ sở (0)
Mức trên
(+1) +α
X1 35 40 45 50 55
X2 90 100 110 120 130
X3 3 4 5 6 7
Ghi chú: = 2, Umax, Umin là giá trị cận trên (+1) và cận dưới (-1) của biến độc lập, U0= (Umin+ Umax)/2 là giá trị trung bình của cận trên và cận dưới.
Trong đó: X1 là nồng độ NaOH (%), X2 là nhiệt độ (oC), X3 là thời gian (giờ).