CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 2.4: Quy trình nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định một số hợp chất chính trong cao chiết bằng GC–MS/MS
Nguyên tắc
GC – MS / MS là một hệ thống phân tích sắc kí khí kết hợp với khối phổ song song. Mẫu được làm bay hơi và đi qua một cột mao quản chứa pha tĩnh. Các hợp chất trong mẫu được khí trơ như argon, heli,… đẩy ra một cách lần lượt theo thời gian.
Khi ra khỏi cột phân tích, các chất phân tích đi vào khối phổ kế song song (MS / MS) bao gồm hai máy phân tích khối lượng được ngăn cách bằng một ô va chạm.
Các mảnh được chọn trong máy phân tích đầu tiên được phản ứng với khí trơ trong ô va chạm, dẫn đến phân mảnh tiếp tục. Các ion sản phẩm con này sau đó được phân giải trong ba tứ cực để phân tích. Các ion được phân tích dựa trên tỷ lệ khối lượng và điện tích (m/z) khác nhau của chúng.
Cách tiến hành
Mẫu được chiết được pha trong dung môi methanol bằng sóng siêu âm, được lọc qua màng lọc PTFE 0,45um và đem phân tích định tính bằng phương pháp GC- MS/MS. Sử dụng hệ sắc ký khí khối phổ GC-MS/MS 7000D Triple Quad của hãng Agilent. Điều kiện chạy sắc ký khối phổ sử dụng cột DB-5ms: 30m x 250àm x 0.25àm. Nhiệt độ vũi phun khớ là 230 oC. Chương trỡnh nhiệt độ: 50 oC - 2 phỳt;
tăng 10 oC/phút cho tới 250 oC. Tổng thời gian chạy là 30 phút. Nguồn ion hóa là EI, với năng lượng ion hóa là 70eV. Quét khối phổ với dải quét là 100-350.
Cách đánh giá kết quả
Kết quả sau chạy được định tính trên dữ liệu của thư viện NIST 14 để xác định chất.
2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym - glucosidase Nguyên tắc phản ứng
Enzym α-glucosidase xúc tác quá trình chuyển cơ chất p-nitrophenyl- α-D- glucopyranoside thành α-glucose và p-nitrophenol có màu vàng nhạt- hấp thụ cực đại tại 405 nm. Chất kìm hãm enzym làm cường độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm. Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch khi có hoặc không có mặt chất thử. Từ đó suy ra phần trăm ức chế enym. Dựa vào phần mềm xác định IC50 (nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% enzym). Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp.
Cách tiến hành
Hoạt động ức chế α-glucosidase của cao chiết lá chè đắng được thực hiện bằng phương pháp sau [43]:
Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) và 50 àl được đưa vào cỏc giếng của khay 96 giếng để cú nồng độ 256 àg/ml, 64 àg/ml; 16 àg/ml; 4 àg/ml;
20 àl -glucosidase (0,2U/ml) và 130 àl đệm phosphate 100 mM (pH 6,8) được thêm cho mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37°C trong 15 phút.
Cơ chất -nitrophenyl- -D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng nghiệm rồi ủ tiếp ở 37°C trong 60 phút.
Đĩa thí nghiệm chỉ có mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng (blank). Giếng thí nghiệm chỉ có DMSO 10%, đệm phosphate, enzyme và pNPG được sử dụng làm đối chứng. Thí nghiệm được y lặp lại 3 lần để đảm bảo sự chính xác.
Dừng thớ nghiệm bằng cỏch thờm vào 80 àl Na2CO3 0,2M. Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên BIOTEK với bước sóng 410 nm (A).
Tính toán và xử lý số liệu
Khả năng ức chế enzym a-glucosidase của mẫu được xác định theo công thức:
Độ ức chế (%) = (A(đối chứng) – A(mẫu thử)) A(đối chứng) x 100%
Giá trị IC50 được xác định bằng phần mềm TableCurve 2Dv4.
2.3.3. Phương pháp gây đái tháo đường trên chuột béo phì 2.3.3.1. Gây béo phì
Chuột được nuôi ở điều kiện bình thường, và cho ăn thức ăn tiêu chuẩn trong 5 ngày để thích nghi với điều kiện môi trường mới. Sau đó được phân ngẫu nhiễn thành 2 nhóm.
Nhóm 1: chế độ ăn bình thường (thức ăn tiêu chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp)
Nhóm 2: chế độ ăn với thức ăn giàu dinh dưỡng (35% chất béo mỡ lợn) để gây béo phì.
Chuột của hai nhóm được nuôi trong 28 ngày liên tục. Sau 28 ngày nuôi, tiến hành cân trọng lượng để chọn những con chuột đạt trọng lượng trên 35g được coi là đạt tiêu chuẩn để tiến hành gây mô hình đái tháo đường.
2.3.3.2. Gây ĐTĐ typ 2 bằng Streptozocin
Sau khi gây được mô hình chuột béo phì thành công, tiến hành gây ĐTĐ typ2.
Phương pháp tạo mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở chuột được thực hiện bằng cách tiêm STZ màng bụng. STZ được pha trong đêm citrat 0.01M, pH = 4.3 (pha 250ml đệm citrate gồm: 0,2966 g axit citric monohydrate và 0,2996 natri citrate dihydrat). Sau khi nuôi, chuột được nhịn đói khoảng 8h, tiến hành tiêm màng bụng STZ liều 50mg/kg trong 3 ngày liên tiếp. Sau một giờ kể từ khi tiêm STZ bổ sung thức ăn theo chế độ dinh dưỡng ban đầu trong 10 ngày và theo dõi nồng độ đường huyết. Tiến
hành đo đường huyết máu đuôi chuột vào ngày thứ 5. Chọn các chuột béo phì bị ĐTĐ (có nồng độ glucose huyết lúc đối trên 10 mmol/L được cọi là ĐTĐ) tham gia tiếp nghiên cứu [30].
2.3.4. Đánh giá tác dụng hạ glucose của dịch chiết lá chè đắng Phân lô nghiên cứu
Chuột bị ĐTĐ type 2 được tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết khi xử lý với các mẫu nghiên cứu khác nhau. Chuột được phân thành 5 nhóm ngẫu nhiên.
Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý, chuột bình thường, cho uống nước cất
Nhóm 2: Nhóm chứng bệnh tiểu đường: chuột bị tiểu đường do tiêm STZ và uống nước cất
Nhóm 3: Nhóm chứng dương: chuột tiểu đường do tiêm STZ và cho uống glibenclamid liều 50mg/kg
Nhóm 4: Chuột tiểu đường do tiêm STZ cho uống cao chiết lá chè đắng liều 100mg/kg (liều 1)
Nhóm 5: Chuột tiểu đường do tiêm STZ và cho uống cao chiết lá chè đắng liều 200mg/kg (liều 2)
Các nhóm chuột được điều trị trong 28 ngày. Trọng lượng của chuột được theo dõi mỗi ngày, và chuột được uống nước cất, uống thuốc và cao chiết cố định vào 8-9 giờ sáng hàng ngày. Đường huyết của chuột được theo dõi vào buổi sáng (sau khi nhịn ăn cả đêm trước khi đo) các ngày 0, thứ 10, thứ 20 và thứ 28. Sau khi đo đường huyết, chuột được cho ăn và uống nước bình thường.
Cách pha mẫu
Cao chiết lá chè đắng được hòa tan vào nước thành nồng độ 200mg/ml (liều 1)và 400mg/ml (liều 2) và cho chuột uống theo cân nặng của chuột (0.05ml/10g) ở nhóm 4 và nhóm 5
Định lượng glucose trong máu chuột
Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột. Định lượng glucose máu bằng máy đó đường huyết tự động On Call Plus (Johnson & Johnson, USA) và có bộ que thử tương ứng.
Nguyên tắc: Glucose trong máu phản ứng với oxy không khí dưới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong que thử tạo thành axit gluconic và H2O2. H2O2 sau đó phân hủy giải phóng oxy, oxy hóa dianisidin tạo thành phức chất màu vàng. Độ đậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ glucose chứa trong mẫu máu.
Quy trình đo đường huyết với máy On Call Plus
Máy On Call Plus là máy bán tự động đo được glucose trong máu toàn phần.
Gắn một que thử để khởi động máy. Nhấn nút C để chọn mã số phù hợp với mã que thử.
Tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dựng cho việc đo là khoảng 1 àl. Thấm nhẹ giọt mỏu vào một đầu que, mỏu sẽ tự thấm vào đầu que thử. Sau 7 giây kết quả hiện thị trên hình.
2.3.5. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của dịch chiết lá chè đắng
Sau khi kết thúc thí nghiệm (28 ngày). Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Chuột được gây mê bằng diethyl ether, dùng kim tiêm 1 mL để tiến hành lấy máu tim chuột. Sau 28 ngày điều trị, mẫu nhược thu thập vào các ống có chứa heparin. Huyết thanh được tách ra bằng cách ly tâm ở 3000 vòng/phút ở 25°C trong 15 phút và được gửi đến bệnh viện Đại học Y Hà Nội để phân tích các chỉ số hóa sinh: cholesterol tổng, cholesterol, HDL cholesterol, triglycerid.
Nguyên tắc: Định lượng Cholesterol huyết thanh
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng hydrogen peroxide với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác cà peroxidase.
Tính kết quả: Đo mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn Nguyên tắc định lượng triglycerid huyết thanh
Thuỷ nhân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyryl và 4 - chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các như phản ứng sau:
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại.