CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá cây Mơ
➢ Định tính alcaloid
Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9- 10.Chiết alcaloid base bằng chloroform (3 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó đem lắc với H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5 mL). Gộp các dịch chiết nước chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để làm các phản ứng:
• Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính.
15
• Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính.
➢ Phương pháp định tính iridoid glycosid
Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL. Thêm 15 mL ethanol 90%, thỉnh thoảng lắc. Sau vài giờ gạn lấy dịch chiết.
• Phản ứng với thuốc thử Trim-Hill
Thuốc thử Trim-Hill: 10ml acid acetic + 1ml CuSO4 0,2% + 0,5ml HCl 1%.
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ethanol, thêm 15 ml thuốc thử. Đun nóng sẽ xuất hiện màu xanh dương hoặc tím đỏ. Tuy nhiên, cũng có một số iridoid glycosid âm tính với thuốc thử trên.
Chuẩn bị: Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2 cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng thu được dịch lọc. Dịch lọc lại đem cô đến cắn (cắn toàn phần).
➢ Định tính saponin
• Quan sát hiện tượng tạo bọt: Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5 mL nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to.
Thêm nước cất đến khoảng 10 mL, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
➢ Định tính flavonoid
Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng:
• Phản ứng với hơi amoniac (NH3): Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với dung dịch kiềm loãng: Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch lọc, 1 ống thêm ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu. Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu
đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì phản ứng dương tính.
• Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid: Cho khoảng 1 mL dịch lọc vào
ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính coumarin
Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc:
+ Ống 1: thêm 0,5 mL NaOH 10%.
+ Ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng.
+ Ống 2: trong suốt.
Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL:
+ Ống 1: trong suốt.
+ Ống 2: có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính.
17
➢ Phương pháp định tính tanin
Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc.
+ Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh
đen thì phản ứng dương tính.
+ Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản
ứng dương tính.
+ Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính.
➢ Phương pháp định tính anthraquinon
Các hợp chất anthraquinon khi tác dụng với kiềm (amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước.
Dựa vào tính chất này, định tính anthraquinon dựa trên phản ứng Borntraeger.
• Phản ứng Borntraeger: Hòa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10 mL chloroform, gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1 mL, thêm 1 mL NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính.
➢ Phương pháp định tính terpenoid
Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm phản ứng
• Phản ứng Salkowski: pha hỗn hợp gồm 1 mL dung dịch mẫu thử, 1 mL chloroform, 1 mL H2SO4 đậm đặc; phản ứng dương tính khi dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh tím.
➢ Phương pháp định tính steroid
18
• Phản ứng Liebermann-Burchard
Cho vào ống nghiệm anhydrid acetic (1 mL), chloroform (1 mL), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu thử vào ở dạng rắn hoặc pha trong chloroform. Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ; màu này bền không đổi.
• Phản ứng Rosenheim:
Cho vào ống nghiệm dung dịch mẫu thử (1 mL), thêm acid trichloroacetic (2 giọt), lắc đều. Phản ứng dương tính là sau 20 phút dung dịch dung dịch đổi thành màu xanh dương.
➢ Định tính đường khử
Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính acid hữu cơ
Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì phản ứng dương tính.
➢ Định tính tinh dầu
Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp, lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm. Thêm 0,1 mL dung dịch NaOH 5% và 3 giọt dung dịch HCl 5%.
Xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ trong thành phần dược liệu có chứa tinh dầu.