Phản ứng caramel xảy ra cả trong môi trường acid (pH<3) và môi trường kiềm (pH >
9) mà không cần xúc tác enzyme. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ nóng chảy của đường và ở các nhiệt độ thấp hơn điểm nóng chảy của đường. Trong môi trường kiềm thì phản ứng mất nước của carbonhydrat chậm hơn trong môi trường acid. Cường độ màu nâu tăng lên với thời gian gia nhiệt và nhiệt độ. Phản ứng caramel phụ thuộc vào nồng độ của đường, pH của môi trường và thời gian đun nóng,... Phản ứng tạo thành 5-HMF của đường frutose nhiều hơn glucose[1].
Bảng 1.2 Nhiệt độ xảy ra phản ứng caramel của một số loại đường
Loại Đường Nhiệt Độ Phản Ứng (ºC)
Fructose 110
Galactose 160
Glucose 160
Mannose 160
Maltose 160
Sucrose 160
Hình 1.16. Quá trình đồng phân hóa aldose thành ketose
Trong môi trường acid, carbohydrate đồng phân được tạo thành với lượng thấp, tuy nhiên sự mất nước của đường lại diễn ra mạnh mẽ dẫn đến tạo thành các hợp chất furaldehyde: 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde từ hexoses và 2-furaldehyde từ pentoses[1].
Hình 1.17. Phản ứng caramel trong môi trường acid
Trong môi trường kiềm quá trình phân hủy đường tạo các sản phẩm như acetone, acetoin, và diacetyl diễn ra mạnh. Tuy nhiên, phản ứng khử nước diễn ra chậm hơn so với môi trường trung tính hoặc acid. Khi có mặt của oxy quá trình phân hủy đường sẽ tạo ra acid formic, axetic, cũng như các acid hữu cơ khác[1].
Hình 1.18. Các sản phẩm tạo ra của quá trình caramel trong môi trường kiềm 1.3. Phương pháp dùng để sản xuất 5-HMF
Hầu hết các phương pháp sản xuất 5-HMF đều yêu cầu nhiệt độ kết hợp với các loại xúc tác khác nhau để khử nước của hexoses. Do đó, việc lựa chọn các chất xúc tác và phương pháp nhiệt khác nhau ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chuyển hoá 5-HMF[6].
Đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các nguồn nhiệt khác nhau để tăng hiệu suất chuyển hoá 5-HMF và hầu hết thiết bị dùng cho các nghiên cứu đã tiến hành đắt tiền, điều kiện làm việc ở áp suất cao, quy trình phức tạp, đòi hỏi người làm phải có đầy đủ về kiến thức và kĩ năng. Thời gian phản ứng dài và chi phí bảo trì bảo dưỡng lớn nên là gánh nặng về kinh tế cho quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp. Một số ví dụ như là:
“Production of 5-Hydroxymethylfurfural from Glucose Using a Combination of Lewis and Brứnsted Acid Catalysts in Water in a Biphasic Reactor with an Alkylphenol Solvent” của Yomaira và các cộng sự, “Optimization Of Production Of 5- Hydroxymethylfurfural From Glucose In A Water: Acetone Biphasic System” của A.
D. M. Mendonca, P. M. Siqueira và các cộng sự và “5-Hydroxymethylfurfural (5-HMF) Production from Hexoses: Limits of Heterogeneous Catalysis in Hydrothermal Conditions and Potential of Concentrated Aqueous Organic Acids as Reactive Solvent System” của Rodrigo Lopes de Souza, Hao Yu, Franck Rataboul and Nadine Essayem.
Phương pháp nhiệt kết hợp xúc tác (acid vô cơ, hữu cơ, base, muối,...) đã được sử dụng để làm tăng hiệu suất chuyển hoá 5-HMF. Xúc tác được sử dụng để tổng hợp 5- HMF đầu tiên là acid oxalic[6] và cho đến nay có gần một trăm các hợp chất vô cơ và hữu cơ có thể làm chất xúc tác để tổng hợp 5-HMF. Cottier đã chia chất xúc tác thành 5 nhóm chính[24].
Acid oxalic Acid levulinic Acid maleic
Acid phosphoric Acid suphuric Acid
hydrochloric Acid hydroiodic
(NH4 )2SO4/SO3
Pyrid/ PO4-3
Pyrid/HCl Muối nhôm Các ion: Cr, Al, Ti,
Ca ZrOCl2, TiO2
ZnCl2
AlCl3
BF3
Nhựa trao đổi ion Zeolit
HCl sẽ là một xúc tác tốt cho quá trình sản xuất 5-HMF và công đoạn tinh chế sẽ đơn giản hơn. Khả năng ứng dụng 5-HMF khi được sản xuất với xúc tác HCl sẽ dễ dàng hơn.
Bởi một số lí do sau: việc loại bỏ hoàn toàn HCl trước khi đưa vào sử dụng trong y học, sinh học và thực phẩm dễ dàng thực hiện khi trung hoà bằng bazơ tạo kết tủa như Ag2+, cường lực xúc tác acid vô cơ HCl mạnh hơn acid hữu cơ do acid hữu cơ dễ dàng bị phân hủy bởi nhiệt độ cao, điều này ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng chuyển hóa fructose thành 5-HMF. Hơn thế nữa, chỉ có HCl được sử dụng như một loại phụ gia thực phẩm do đó an toàn với đối tượng sử dụng[25].
Trong nghiên cứu này sử dụng cơ chất là sucrose để chuyển hóa thành 5- HMF có rất nhiều ưu điểm: Sucrose thuỷ phân tạo thành glucose và fructose là hai cơ chất được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu trước đây để chuyển hoá thành 5-HMF, sucrose là cơ chất sẵn có và giá thành thấp hơn so với fructose, glucose. Do đó tạo điều kiện thuận lợi trong sản xuất trên quy mô công nghiệp.
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích khai thác những ưu điểm vượt trội của nguồn nhiệt thường vi sóng, cơ chất sucrose và xúc tác HCl vào quá trình sản xuất 5-HMF. Đây là một phương pháp hoàn toàn mới chưa từng được thực hiện để chuyển hoá sucrose thành 5-HMF.
1.4. Một số phương pháp định lượng 5-HMF
Trên thực tế đã có nhiều nghiên cứu định lượng 5-HMF trong một số sản phẩm khác nhau. Trong đó, phương pháp đo độ hấp thụ được ứng dụng đầu tiên để xác định 5-HMF trong các chế phẩm. Năm 2012 tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng Việt Nam cũng đã ban hành TCVN-9041 : 2012 xác định hàm lượng 5-HMF bằng phương pháp quang
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao cũng được sử dụng để xác định trực tiếp 5- HMF. Phương pháp này có độ nhạy cao, độ chọn lọc và đặc hiệu cao. Ngoài ra, 5-HMF còn được định lượng bằng phương pháp sắc kí khối phổ. Đây là phương pháp có độ chọn lọc rất cao, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, không bị ảnh hưởng khi có mặt các chất khác trong mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này rất tốn kém, trang thiết bị khá phức tạp[27]. Đối với những mẫu phức tạp thì sự kết hợp giữa sắc kí khối phổ và HPLC sẽ giúp kết quả định lượng chuẩn xác hơn. Trong đề tài này, HPLC được chọn để định lượng 5-HMF.
1.5. Tình hình nghiên cứu 5-HMF tại Việt Nam và trên thế giới 1.5.1. Tại Việt Nam
Cho đến nay, chỉ có một số nghiên cứu về hợp chất 5-HMF tại Việt Nam như: đề tài
“Nghiên cứu sản xuất 5-HMF bằng phương pháp sử dụng xúc tác Amberlyst và hydrotanxit” được công bố vào năm 2015 của tác giả Dương Thị Hiền, đề tài “Nghiên cứu chuyển hoá sucrose thành 5-Hydroxymethyl-2-furfuraldehyde bằng sự kết hợp giữa nhiệt và xúc tác HCl” được công bố vào năm 2017 của tác giả Bùi Viết Cường, Nguyễn Thị Hường.
1.5.2. Trên thế giới
Trên thế giới, đã có hàng ngàn nghiên cứu về phương pháp sản xuất 5-HMF đã được công bố, điều này minh chứng cho tầm quan trọng của hợp chất 5- HMF[6]. Hợp chất 5-HMF và dẫn xuất của nó được phát hiện từ cuối thế kỉ 19 khi Dull mô tả tổng hợp của nó bằng cách nung nóng inulin với dung dịch acid oxalic dưới áp lực. Trong cùng năm đó, Kiermayer báo cáo một phương pháp tương tự để tổng hợp HMF, nhưng bắt đầu từ cây mía. Trong những năm tiếp theo, một số phương pháp khác đã được báo cáo sử dụng đồng nhất và không đồng nhất xúc tác acid, cả trong môi trường nước [28]. Sau đó, Harris mô tả các phản ứng khử nước của tinh bột trong điều kiện có tính acid. Năm 1981, hai nghiên cứu được công bố, gồm sản xuất 5-HMF và tính chất hóa học của 5-HMF.
Năm 1990 và 1991, hai nhận xét quan trọng được công bố bởi Kuster và Cottier mô tả quá trình sản xuất 5-HMF. Gần đây hơn, Lewkowski và Moreau đã xem xét tổng hợp và hóa học của 5-HMF. Woodley cũng tóm tắt một số quy trình cho sự tổng hợp của 5- HMF, và Zhang kết nối chuyển đổi sinh khối với muối imidazolium, bằng cách tổng hợp của 5-HMF với chất lỏng ion làm dung môi. Một số đánh giá là toàn diện, trong khi những người khác chỉ đề cập đến tính chất hóa học 5-HMF, nhưng vấn đề này đã được tiến triển rất nhanh, và hơn 90 bài báo đã được báo cáo trong các tạp chí khoa học năm 2010[28]. Đến nay, HMF vẫn đang được nghiên cứu để có một quy trình tối ưu trong
lò giúp tận dụng tối đa năng lượng vi sóng, bộ cảm biến hồng ngoại phức tạp do tập đoàn CEM sản xuất giúp kiểm soát tốt nhiệt độ của mẫu. Nguyên lí đun nóng bằng vi sóng: tương tự như các dạng truyền nhiệt khác, ở mức phân tử, nhiệt độ là một dạng chuyển hóa của năng lượng hình thành khi các phân tử tăng nhanh sự chyển động hỗn loạn. Vì không xem xét dưới góc độ lượng tử, do đó, xem sự gia tăng chuyển động này là nguyên nhân của sự gia tăng nhiệt độ trong chất[29, 30].
Các dạng truyền nhiệt thông thường như dẫn nhiệt, bức xạ nhiệt hay nhiệt đối lưu thì nhiệt độ đều được truyền từ bên ngoài vào bên trong mẫu. Phần trong chỉ được hâm nóng khi nhiệt được truyền vào từ ngoài. Trái lại, trong lò vi sóng năng lượng từ Magnetron xuyên qua mẫu, nghĩa là toàn bộ, cả trong lẫn ngoài của mẫu đều được đun nóng đồng thời. Đây chính là ưu điểm lớn của vi sóng. Trong mẫu thường luôn có các phân tử phân cực, tiêu biểu như là nước, để truyền năng lượng cho các phân tử này thì mẫu được đặt trong lò vi sóng và chịu tác dụng của các sóng điện từ tạo ra từ ống Magnetron, các sóng này sinh ra một trường điện từ thay đổi hướng liên tục. Trong lò vi sóng, hướng của trường điện từ thay đổi hơn 2 tỷ lần mỗi giây. Các phân tử lưỡng cực (moment lưỡng cực của chúng) sẽ sắp xếp theo hướng của điện trường. Sự thay đổi của điện trường làm tăng dao động của các phân tử phân cực và làm tăng ma sát giữa các phân tử, nhiệt sinh ra từ các liên kết Hydro bị gãy[29, 30].
Nguồn nhiệt vi sóng có nhiều ưu điểm như: thời gian nâng nhiệt nhanh do lò vi sóng có thể cung cấp năng lượng trực tiếp tới vật liệu đích bằng bức xạ ở tốc độ ánh sáng mà không dẫn hoặc đối lưu của các quá trình chính của chuyển giao năng lượng trong sưởi ấm thông thường[31], thời gian nâng nhiệt nhanh, nhiệt tác dụng đều lên toàn mẫu và đun nóng không tiếp xúc.
1.7. Lý thuyết quy hoạch thực nghiệm 1.7.1 Các bước quy hoạch thực nghiệm[32]
► Chọn thông số nghiên cứu: Phân tích để chọn ra các yếu tố ảnh hưởng chính, loại bớt các yếu tố không cần thiết nhằm đảm bảo tính khả thi và hiệu quả của thực nghiệm.
► Lập kế hoạch thực nghiệm: Chọn kế hoạch thí nghiệm phù hợp với điều kiện tiến hành thí nghiệm và với đặc điểm của các yếu tố của đối tượng.
Sử dụng phương pháp bình phương nhỏ nhất và các nội dung phân tích hồi quy, phân tích phương sai để xác định các giá trị của hệ số trong mô hình hồi quy đa thức, kiểm tra mô hình theo độ tương thích và khả năng làm việc. Mô hình phi tuyến có dạng phương trình:
Các hệ số hồi quy B= [b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b11, b22, b33] trong phương trình hồi quy cấp 2 mô tả 3 yếu tố ảnh hưởng được xác định theo công thức tổng quát dưới dạng ma trận B= [X*X]-1X*Y. Trong đó, X* là ma trận chuyển vị của ma trận kế hoạch. Mô hình thống kê thực nghiệm chỉ có thể sử dụng khi đã thoả mãn các tiêu chuẩn thống kê (Student vs Fisher).
1.7.2 Tối ưu hoá
Các bước giải bài toán tối ưu hoá[32]:
+ Chỉ ra hàm mục tiêu: Y MAX hay là Y MIN.
+ Xây dựng mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng và hàm mục tiêu theo qui luật biết trước hoặc mô hình thống kê thực nghiệm.
+ Tìm thuật giải.
+ Phân tích và đánh giá kết quả thu được.
1.7.3. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) [33]
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích nhiều biến phương trình. Hai tác giả GEP Box và KB Willson năm 1951 đã giới thiệu phương pháp RSM này. RSM sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một mục tiêu tối ưu. Để RSM làm được một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một mục tiêu cực đại hoặc cực tiểu, Box và Willson đã sử dụng một mô hình đa thức bậc hai. Mô hình này ước lượng xấp xỉ hàm mục tiêu, nhưng lại tương dối dễ áp dụng.
► Nguyên tắc của RSM: Những biến đầu vào gọi là biến cơ sở và khi thay đổi biến cơ sở Xi thì sẽ kéo theo sự thay đổi của hàm mục tiêu Y. Mối tương quan giữa X,Y được thể hiện qua sơ đồ sau:
Hình 1.19. Sơ đồ chuyển đổi X sang Y
Biến cơ sở Xi RSM Hàm mục tiêu Y
thích hợp của dữ liệu. Cách dữ liệu được mã hóa ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
► Chức năng của RSM: dùng để khảo sát mối quan hệ giữa một hay nhiều biến thực nghiệm nhằm đáp ứng được hàm mục tiêu, xây dựng mô hình thể hiện mối quan hệ giữa các yếu tố với hàm mục tiêu. Phương pháp RSM này thường được áp dụng sau khi đã xác định được các yếu tố quan trọng có thể kiểm soát được và muốn tìm được các giá trị cụ thể của các biến để đạt được hàm mục tiêu.
► Ưu nhược điểm của RSM: về ưu điểm thì RSM có thể áp dụng cho bất kì hệ thống nào mà có đầu vào là các biến cơ sở và đầu ra là hàm mục tiêu, thực hiện số thí nghiệm vừa phải, nhanh chóng và RSM có thể đánh giá được mức độ tác động của các yếu tố lê hàm mục tiêu. Tuy nhiên, RSM có những nhược điểm như độ chính xác tương đối cao, chỉ đúng với khoảng biến thiên đã khảo sát của các yếu tố cơ sở.
► Phương pháp cấu trúc tâm quay Central Composite Design: được cấu thành từ 3 thành phần:
+ Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một hình khối đều trong không gian k chiều. Nếu k > 5 có thể giảm bớt số thí nghiệm bằng cách sử dụng phương án yếu tố từng phần 2k-1.
+ 2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố. Các tọa độ của các điểm sao là (±α, 0, 0,…0), (0,±α, 0,…0), (0, 0 ,…,0, ±α), α là khoảng cách từ tâm phương án đến điểm sao được gọi là cánh tay đòn sao. Các điểm sao là cần thiết để mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của 1 yếu tố đơn để có thể tìm được các ước lượng của hệ số bjj trong phương trình hồi quy bậc 2.
+ Nghiệm phương trình ở tâm phương án dùng để tìm phương sai tái hiện. Cánh tay đòn sao α và số thí nghiệm ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối ưu, thường là phuơng án trực giao hay phương án quay.
Trong CCD giá trị α rất quan trọng, vì nó có thể xác định vị trí của các điểm trục trong miền thử nghiệm. Giá trị α được tính theo công thức:
α = (2k)0,25
Kết quả thực nghiệm thu được, sử dụng phương pháp hồi quy bề mặt đáp ứng của hệ thống phân tích thông kê. Mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và các biến độc lập được thể
Y =b0 + ∑ bixi
k
i=1
+ ∑ bii
k
i=1
xii2∑ ∑ bijxixj
k
i≠j=1 k
i=1
+
Trong đó:
Y là hàm mục tiêu mong muốn (đáp ứng), k là tổng số các yếu tố độc lập,
b0: hệ số hồi qui bậc 0,
bi: Hệ số tuyến tính của từng yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y,
bij: Hệ số tương tác cặp của các yếu tố ảnh hưởng với nhau đến hàm mục tiêu Y, bii: Hệ số bậc 2 của từng yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y.
Phướng án cấu trúc có tâm là thiết kế thí nghiệm mà trong đó mỗi yếu tố số đa dạng hơn 5 cấp độ: cộng alpha (+α), trừ alpha (-α), cộng một (+1), trừ một (-1) và điểm trung tâm (0). Nếu yếu tố phân loại được thêm vào, thiết kế trung tâm tổng hợp sẽ nhân đôi cho mỗi sự kết hợp của các cấp yếu tố phân loại. Phương án cấu trúc có tâm với 2 yếu tố được trình bày trong hình 1.20.
a) Các điểm trong phần nhân tố của mẫu được mã hóa là -1 và +1
b) Các điểm trong phần trục (ngôi sao) của mẫu là ở : (+ , 0), (−, 0), (0,+ ), (0,− )
c) Ở đây , phần nhân tố và trục dọc theo điểm trung tâm ở (0,0) được trình bày.
Hình 1.20. Các điểm tượng trưng cho các thí nghiệm thực nghiệm được thực hiện
Sucrose (merck- Đức), acid clohydric (36 - 38%), nước khử ion (DI), methanol (Sigma-Aldrich USA), natri hydroxit khan (96%)(Trung Quốc).
2.1.2. Các máy móc, thiết bị nghiên cứu
Cân kỹ thuật điện tử, máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) (Dionex Ultimate 3000, Thermo Scientific, Mỹ) với cột C18 (Dionex, 5 àm, 120 Å, 4,6 x 50 mm), mỏy vi súng MARS EXPRESS 5 của CEM Coporation. Và một số dụng cụ, máy móc thiết bị thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm như ống nghiệm, ống Vancon, bình định mức 10 mL, 100 mL, ống đong 100 mL, 250 mL, 500 mL, cốc thủy tinh, pipet, micropipet, giá đựng ống nghiệm,...
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Xây dựng mô hình toán học và ma trận thực nghiệm
Mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa 5-HMF là phi tuyến;
do đó, mô hình toán học cấp 2 được lựa chọn đểmô tả ảnh hưởng của các yếu tố và sự tương tác giữa các yếu tố đến hiệu suất chuyển hóa 5-HMF. Dựa trên khảo sát đơn biến mức, khoảng biến thiên các yếu tố được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2.1. Mức, khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố ảnh hưởng Khoảng biến thiên
Mức dưới Mức cơ sở Mức trên
Thời gian( phút) 15 20 25
Nồng độ( M) 0,5 0,7 0,9
Tỉ lệ thể tích xúc tác
HCl: sucrose (mL:g) 8:1 10:1 12:1
Phương trình hồi qui cấp 2 có dạng[34, 35]:
H = bo + b1T + b2C + b3R + b12TC + b13TR + b23CR + b11T2 + b22C2 + b33R2 Trong đó:
T: Thời gian phản ứng (phút), C: Nồng độ chất xúc tác HCl (M),
R: Tỉ lệ thể tích xúc tác HCl:sucrose (mL:g),
bi (i=1,2,3): Hệ số bậc tuyến tính của các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hoá