CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame.
Dùng que cấy lấy một ít sinh khối .
Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh trong 1 phút.
Rửa nước.
Nhuộm lugol trong 1 phút.
Rửa nước.
Rửa cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.
Rửa nước.
Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin từ 10 – 30 giây.
Rửa nước.
Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu.
2.3.2. Phương pháp nhuộm bào tử
Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi trên lame.
Đặt một cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng giấy lọc.
Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong khoảng thời gian 5 phút.
Sau đó rửa vết bôi bằng nước cất trong khoảng thời gian 30 giây.
Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60-90 giây.
Rửa lại bằng nước rồi thấm khô.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X.
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó cá chủng này được chuyển vào tủ mát từ 30C – 50C để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, nhằm đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian dịnh kì cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền 1 lần.
Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C. Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dung que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới đem đi ủ, thời gian ủ từ 48-72 giờ.
Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C ( Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.4. Phương pháp tăng sinh và xác định mật độ vi khuẩn
a. Mục đích:nhằm hoạt hóa các vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản.
b. Nguyên tắc
Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng thích hợp không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường.
c. Cách tiến hành
Đối với giống vi khuẩn được giữ trong glycerol 20%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối của vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml BHI trong điều kiện vô trùng.
Sau đó, ủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng λ = 600nm.
d. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland) Mật độ (cfu/ml) = OD600nmx 1,02 x 109
2.3.5. Phương pháp bảo quản lạnh sâu.
Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong máy bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và tan nhanh như glycerol.
Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 2 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu
cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Văn Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme amylase a. Nguyên tắc của thử nghiệm
Mục đích là để xác định xem vi khuẩn có khả năng sản sinh ra enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay không?
b. Cơ sở sinh hóa
Tinh bột là một đại lượng phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có hai dạng amylose và amylopectin. Amylase là phân tử tinh bột dạng thẳng không có phân nhánh, cấu tạo từ 200 – 300 đơn vị, trong khi đó amylopectin là phân tử phân nhánh. Tinh bột dễ dàng bị thủy phân bởi các vi sinh vật có khả năng sản sinh ra enzyme amylase để tạo thành dextrin, maltose và glucose.
Để phát hiện khả năng phân hủy tinh bột, sử dụng thuốc thử glugol làm chất chỉ thị.
Khi có sự hiện diện của tinh bột, iodine tạo phức màu nâu. Khi tinh bột bị enzyme thủy phân, iodine không tạo phức nên màu nâu biến mất.
c. Cách tiến hành thí nghiệm
Đầu tiên, tiến hành tăng sinh chủng vi khuẩn B.velezensis phân lập trong môi trường BHIB trong 24 giờ ở 370C. Sau đú pha loóng về mật độ 108cfu/ml, hỳt 100àl dịch cho vào môi trường BHIA, trang đều ủ ở 370C trong 24 giờ.
Trên các đĩa môi trường Starch Agar, đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó gắp khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn cho vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Sau 24 giờ nhỏ lugol vào đĩa và đọc kết quả.
d. Đọc kết quả
Thử nghiệm ( + ): xuất hiện vòng phân giải của tinh bột (màu vàng của lugol) Thử nghiệm ( - ): toàn bộ đĩa xuất hiện màu xanh đen.
2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase a. Nguyên tắc của thử nghiệm
Mục đích là để xác định xem vi khuẩn có khả năng sản sinh ra enzyme cellulase thủy phân cellulose thành glucose hay không?
b. Cơ sở sinh hóa
Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-α-D-glucan cellobiohydrolase). Enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết α -1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α -1,4-glucoside). Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng.
Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase (endoglucanase; 1,4-β-D-glucan-4- glucanohydrolase). Enzyme này thủy phân liên kết α-1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như CMC và HEC.
Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh.
α -glucosidase (cellbiase; α -D-glucoside glucohydrolase) không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D- glucose.
c. Cách tiến hành thí nghiệm
Tiến hành chuẩn bị dịch vi khuẩnB.velezensisnhư trên.
Trên đĩa môi trường CMC, tiến hành đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó gắpcác khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Sau đó nhỏ lugol vào và đọc kết quả.
d. Đọc kết quả
Thử nghiệm ( + ): không xuất hiện màu nâu xung quanh điểm cấy.
Thử nghiệm ( - ): toàn bộ đĩa xuất hiện màu nâu của phức hợp glugol và cellulose.
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý với phần mềm Microsoft Excel 2010 phần mềm SAS 9.4.