Phản ứng thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi mủ đu đủ là phản ứng quan trọng của nghiên cứu này. Mục đích của việc khảo sát là tìm điều kiện để enzyme thủy phân dầu cá cho hiệu suất cao nhất. Hiệu suất của phản ứng thủy phân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ, chất kìm hãm, chất hoạt hóa…Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến
hiệu suất của quá trình thủy phân như: nhiệt độ, tỷ lệ nước/cơ chất và pH. Kết quả được đánh giá thông qua hiệu suất phản ứng (%) được xác định như mô tả ở phần 2.2.4.4.
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
Nhiệt độ là yếu tố tác động mạnh mẽ đến hiệu suất của phản ứng xúc tác bởi enzyme. Khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng cũng tăng, hiện tượng này tuân theo quy luật Van – Hoff. Nhưng đến một giới hạn nào đó khi vận tốc phản ứng đạt cực đại, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì vận tốc của phản ứng sẽ giảm. Nhiệt độ mà tại đó enzyme hoạt động mạnh nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Mỗi enzyme có một vùng hoạt động khác nhau.
Để xác định nhiệt độ tối ưu của phản ứng, chúng tôi tiến hành thủy phân dầu cá với các thông số cố định: tỷ lệ nước/cơ chất 5/1, tỷ lệ enzyme/cơ chất 4% (w/w), thời gian dự kiến là 24 giờ, pH = 8 và tốc độ lắc 200 vòng/phút. Yếu tố nhiệt độ thay đổi là 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC và 50oC. Kết quả khảo sát thể hiện qua bảng 3.3 và đồ thị 3.4 bên dưới.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng thủy phân Nhiệt độ (oC) Hiệu suất (%)
25 45,248b
30 56,302a
35 56,044a
40 50,586b
45 38,500c
50 36,932c
*Ghi chú: Các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05).
b
a a
b
c
c
35 40 45 50 55 60
25 30 35 40 45 50
Hiệu suất (%)
Nhiệt độ(oC)
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân
➢ Nhận xét:
Đồ thị ở hình 3.4 cho thấy rằng hiệu suất của phản ứng thủy phân tăng khi nhiệt độ tăng từ 250C đến 300C, sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 350C đến 500C. Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 56,30% khi thủy phân ở nhiệt độ 30oC.
Nhiệt độ tối ưu này thấp hơn công bố trong nghiên cứu của Pierre Villeneuve và cộng sự khi nghiên cứu lipase từ Babaco (một loại quả thuộc họ đu đủ được trồng phổ biến ở New Zealand và Anh), với nhiệt độ tối ưu là 50oC [25]. Sự khác biệt này có thể là do sự khác nhau về giống và các giống đu đủ này được trồng ở các nước khác nhau.
➢ Giải thích kết quả thí nghiệm:
Từ 25÷ 300C hiệu suất của phản ứng thủy phân tăng dần, điều này có thể giải thích dựa vào động học phản ứng enzyme. Khi nhiệt độ tăng làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn. Các phức chất enzyme–cơ chất hình thành nhiều hơn, vận tốc phản ứng thủy phân cũng tăng theo và đạt cực đại tương ứng tại nhiệt độ tối ưu ở điểm khảo sát 300C.
Từ 30÷500C hiệu suất của phản ứng thủy phân giảm dần do enzyme có bản chất là protein nên khi tăng nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu thì sẽ xảy ra quá trình biến tính enzyme. Nghĩa là ở nhiệt độ cao hơn 30oC một số liên kết hydro làm nhiệm vụ giữ vững cấu trúc của lipase trong mạng lưới liên kết bị đứt gãy dẫn đến cấu trúc của enzyme bị biến đổi, làm cho cơ chất không liên kết được với enzyme và không bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. Do vậy mà vận tốc phản ứng xúc tác enzyme bị giảm.
3.5.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/cơ chất đến hiệu suất của quá trình thủy phân Do enzyme lipase chỉ có khả năng thủy phân dầu trên bề mặt liên pha vì vậy mà chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ nước/dầu. Trong các phản ứng mà enzyme không hòa tan được trong chất nền như dầu thì sự có mặt của nước trong phản ứng là rất quan trọng. Nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước/cơ chất có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme.
Để xác định tỷ lệ nước/cơ chất tối ưu cho phản ứng thì quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ tối ưu đã khảo sát ở trên là 30oC, tỷ lệ enzyme/cơ chất dự kiến là 4% (w/w), thời gian dự kiến là 24 giờ, pH = 8 và tốc độ lắc 200 vòng/phút. Yếu tố tỷ lệ nước/cơ chất (w/w) thay đổi từ 3/1; 4/1; 5/1; 6/1 và 7/1. Kết quả khảo sát thể hiện qua bảng 3.4 và đồ thị 3.5 bên dưới:
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/cơ chất đến hiệu suất của phản ứng thủy phân Tỷ lệ nước/cơ chất (w/w) Hiệu suất (%)
3/1 36,853c
4/1 45,248b
5/1 56,302a
6/1 48,225b
7/1 50,447b
*Ghi chú: Các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05).
b b
a
b
c
35 40 45 50 55 60
3/1 4/1 5/1 6/1 7/1
Hiệu suất (%)
Tỷ lệ nước/cơ chất (w/w)
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ nước/cơ chất đến quá trình thủy phân
➢ Nhận xét:
Đồ thị trên cho thấy rằng hiệu suất của phản ứng thủy phân tăng dần khi tỷ lệ nước/cơ chất tăng từ 3/1 đến 5/1, sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng tỷ lệ nước/cơ chất lên 7/1. Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 56,30% khi thủy phân ở tỷ lệ nước/cơ chất là 5/1.
➢ Giải thích kết quả thí nghiệm:
Khi tăng hàm lượng nước từ 3/1 đến 5/1 thì hiệu suất của phản ứng xúc tác enzyme tăng vì nước giúp hòa tan enzyme và phân tán enzyme vào bề mặt phân pha dầu nước, tăng hàm lượng nước sẽ giúp enzyme phân tán tốt vào bề mặt phân pha làm cho sự tương tác giữa enzyme và cơ chất diễn ra tốt hơn, do đó làm tăng hoạt lực của enzyme. Tuy nhiên, hàm lượng nước quá nhiều thì sẽ làm cho enzyme bị loãng, bị phân tán rộng, không nằm hoàn toàn giữa bề mặt phân pha do đó sẽ làm giảm hoạt lực của enzyme. Hơn nữa, nước cũng là chất trực tiếp tham gia vào phản ứng thủy phân, đây là phản ứng thuận nghịch, nếu lượng nước quá ít thì cân bằng sẽ chuyển dịch theo hướng tạo phản ứng ester. Vì vậy, 5/1 là tỷ lệ nước/cơ chất tối ưu để cân bằng phản ứng chuyển dịch theo hướng tạo acid béo và glycerol với một lượng cơ chất nhất định và enzyme hoạt động tốt nhất ở bề mặt phân pha dầu nước tạo ra hiệu suất cao cho phản ứng thủy phân.
3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất của quá trình thủy phân
pH có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến hiệu suất của quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, độ bền của cấu trúc protein mà enzyme có nguồn gốc protein nên khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu tạo nên trung tâm hoạt động của enzyme như - OH, - SH.... Hơn nữa, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh trong 1 dải pH nhất định và ở giá trị pH mà tại đó enzyme hoạt động mạnh nhất gọi là pH tối ưu.
Để xác định pH tối ưu của phản ứng thì quá trình thủy phân được tiến hành ở nhiệt độ và tỷ lệ nước/cơ chất (w/w) tối ưu đã khảo sát ở trên là 30oC và 5/1 trong thời gian 24 giờ, tỷ lệ enzyme/cơ chất 4% (w/w) và tốc độ lắc 200 vòng/phút. Yếu tố pH thay đổi từ 6; 7; 8; 9 và 10. Kết quả khảo sát thể hiện qua bảng 3.5 và đồ thị 3.4 bên dưới:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất của phản ứng thủy phân
pH Hiệu suất (%)
6 55,369a
7 57,731a
8 56,302a
9 32,705b
10 27,486c
*Ghi chú: Các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05).
a a a
b
c
25 30 35 40 45 50 55 60
6 7 8 9 10
Hiệu suất (%)
pH
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
➢ Nhận xét:
Kết quả trên hình 3.6 cho thấy hiệu suất phản ứng thủy phân tăng khi pH tăng từ 6 đến 7, sau đó hiệu suất thủy phân giảm dần khi ta tiếp tục tăng pH từ 8 đến 10. Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 57,73% khi thực hiện phản ứng thủy phân trong môi trường có giá trị pH=7. Giá trị pH này bằng với kết quả của Pierre Villeneuve và cộng sự khi nghiên cứu lipase từ Babaco (một loại quả thuộc họ đu đủ được trồng phổ biến ở New Zealand và Anh), với pH tối ưu ở giá trị 7 [25].
➢ Giải thích kết quả thí nghiệm:
Hiệu suất phản ứng thủy phân tăng khi pH tăng từ 6 đến 7. Điều này có thể giải thích dựa vào trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất, khi pH tăng thì đồng thời trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất cũng thay đổi theo hướng hình thành phức hợp enzyme–cơ chất bền hơn dẫn đến làm tăng hiệu suất phản ứng.
Sau khoảng pH=7-8, hoạt lực enzyme giảm nhanh do sự ion hóa các nhóm chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình không gian của enzyme nên không thể tương tác với cơ chất được.