CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
Cơ thị đỏ cá ngừ sọc dưa được rã đông đến nhiệt độ phòng, 1 g cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được hòa trộn đều với xúc tác NaOH ở nồng độ và thể tích xác định trong cốc sứ kín (50 mL). Quá trình thu hồi được thực hiện với tủ ấm (Daihan IS – 30 - Hàn Quốc) và tủ sấy (Ketong, 101-2, Trung Quốc). Sản phẩm thô thu được sau phản ứng thủy phân
GVHD: ThS. Bùi Viết Cường SVTH: Trần Thị Thu Vân 21
được làm nguội tới nhiệt độ phòng và lọc qua giấy lọc (Whatman, No.1). Dịch lọc được bảo quản ở 4°C cho các phân tích tiếp theo, chất rắn còn sót lại trên giấy lọc được sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 100°C dùng để xác định hiệu suất thu hồi. Quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa với xúc tác NaOH ở các điều kiện được thực hiện 3 lần.
2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa Thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (protein, lipid, tro tổng và ẩm) được phân tích theo phương pháp chuẩn của Cộng đồng phân tích (AOAC) [44].
2.2.2.1. Xác định hàm lượng ẩm trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
Mẫu phân tích (5g) được chuyển vào cốc sứ và được sấy đến khối lượng không đổi ở 100°C trong thời gian 18 giờ. Mẫu thu được sau quá trình sấy được làm nguội trong bình hút ẩm. Chênh lệch khối lượng giữa hai lần sấy liên tiếp không nhỏ hơn 3 mg-5 mg. Phần trăm ẩm của nguyên liệu được xác định theo công thức:
Ẩm (%) 2
1
(w w)
(w w) 100%
= −
−
Trong đó: w: Trọng lượng của cốc sứ sạch (g),
w1: Trọng lượng của cốc sứ sạch và mẫu phân tích ban đầu (g), w2: Trọng lượng của cốc sứ và mẫu phân tích sau sấy (g), 2.2.2.2. Xác định hàm lượng tro tổng số trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
Mẫu phân tích (5g) được chuyển vào một cốc sứ sạch và được nung trong lò ở 525˚C trong 6 giờ cho đến khi tro không có carbon. Mẫu thu được sau quá trình sấy được làm nguội trong bình hút ẩm và cân. Quá trình này được lặp lại cho đến khi chênh lệch giữa hai lần nung liên tiếp nhỏ hơn 1 mg. Phần trăm tro tổng của nguyên liệu được xác định theo công thức:
Tro tổng (%) 2
1
(w w)
(w w) 100%
= −
−
Trong đó: w1: Trọng lượng của cốc sứ và mẫu phân tích ban đầu (g), w2: Trọng lượng của cốc sứ và mẫu phân tích sau khi nung (g), w: Trọng lượng của cốc sứ sạch (g),
2.2.2.3. Xác định hàm lượng protein có trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
Hàm lượng protein trong cơ thịt đỏ cá ngừ được xác định bằng phương pháp Kjeldhal. Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg, chuyển
GVHD: ThS. Bùi Viết Cường SVTH: Trần Thị Thu Vân 22
định lượng vào bình Kjeldahl khô . Thêm khoảng 10 g hỗn hợp xúc tác dạng bột hoặc dạng viên, trộn đều.
Thêm 20 mL axit sulfuric 98%, xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 phút. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl.
Để nguội dịch phân hủy. Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng axit dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.
Cẩn thận pha loãng dịch phân hủy với 250 mL nước cất, thêm vật liệu chống sôi trào và thêm từ từ khoảng 70 mL dung dịch natri hydroxit để tạo thành hai lớp rõ rệt.
Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch axit boric.
Xoay mạnh bình để trộn nhanh lượng chứa trong bình và gia nhiệt đủ. Bật sẵn thiết bị gia nhiệt trước khi nối bình, để giảm thiểu nguy hiểm do chất lỏng chảy ngược trở lại qua sinh hàn. Ngay sau khi trộn, cần tháo bình chứa axit boric để làm khô đầu ra của bình sinh hàn và để cân bằng áp suất trong bình chưng cất.
Chưng cất amoniac vào lượng dư axit boric nồng độ 20 g/lit (khoảng 25 mL), có chứa 0,5 mL chất chỉ thị. Lấy khoảng 180 mL dịch chưng cất và chuẩn độ amoniac bằng dung dịch axit chuẩn độ.
Phần trăm protein nguyên liệu được tính theo công thức:
Nitrogen (%)=(ST−BT) × M ×14 × V × 100 AD × W × 1000
Protein (%) = Nitrogen (%)×6,25 Trong đó:
ST: thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẩu thử (mL) Chất xúc tác
Xanh lá cây
Không màu
GVHD: ThS. Bùi Viết Cường SVTH: Trần Thị Thu Vân 23
BT: thể tích HCl tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (mL) M: nồng độ HCl (M)
V: thể tích mẫu sau khi phân hủy (mL) AD: thể tích mẫu phân hủy được lấy (5mL) W: khối lượng mẫu khô (g)
100: hệ số tính ra phần trăm
2.2.2.4. Xác định hàm lượng chất béo có trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
Hàm lượng chất béo trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được xác định bằng phương pháp Soxhlex. Lấy 10 – 20 g mẫu cho vào bình chiết của thiết bị rồi nối với bình cầu ở dưới. Chất béo thô trong mẫu được chiết bằng dầu ete tuần hoàn chứa trong bình cầu trong 16h, tốc độ tuần hoàn của ete 5 – 8 lần trong 1h. Quá trình chiết được thực hiện trên nồi chưng cách thủy. Chất béo thô được thu nhận trong ống của thiết bị Soxhlet.
Cuối quá trình chiết, ete etylic bị bốc hơi hết và ngưng tụ lên trên bình chiết của máy cất. Chất béo thô được sấy lò bằng không khí nóng với nhiệt độ sấy 80 - 90°C, thời gian 45 - 50 phút. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 10 phút sau đó đem cân. Quá trình sấy được lặp lại cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần liên tiếp nhỏ hơn 1 mg.
Hàm lượng chất béo (X%), được biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo công thức:
X(%)=Mchất béo Mmẫu thử×100 Trong đó:
Mchất béo – khối lượng chất béo thu được (g);
Mmẫu thử – khối lượng mẫu thử (g);
2.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
2.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác NaOH
Quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được thực hiện ở nhiệt độ 30°C, thời gian 10 phút, tỉ lệ cơ chất: thể tích xúc tác NaOH 1:10 (w:v) và nồng độ xúc tác NaOH trong khoảng từ 0,05 đến 0,75 M (khoảng cách giữa hai khảo sát là 0,1 M).
2.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất:thể tích chất xúc tác NaOH
Nồng độ xúc tác NaOH tối ưu được sử dụng cho quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa với nhiệt độ 30°C, thời gian 10 phút và tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác NaOH từ 1:6 đến 1:26 (w:v), khoảng cách giữa 2 lần khảo sát là 4 mL NaOH.
2.2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hòa tan
GVHD: ThS. Bùi Viết Cường SVTH: Trần Thị Thu Vân 24
Nồng độ xúc tác NaOH tối ưu và tỷ lệ cơ chất:thể tích xúc tác tối ưu được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa với nhiệt độ 30°C và thời gian từ 10 đến 80 phút (khoảng cách giữa hai lần khảo sát 10 phút).
2.2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ hòa tan
Quá trình thu hồi protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa được thực hiện ở nồng độ xúc tác NaOH, tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác NaOH, thời gian tối ưu để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ. Nhiệt độ được khảo sát tăng từ 30 đến 100°C (khoảng cách giữa hai lần khảo sát là 10°C).
2.2.4. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu của dịch protein thu hồi được 2.2.4.1. Xác định hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi protein được xác định theo công thức như sau:
h i r
i
H (%)=M -M ×100%
M [45]
Trong đó: Hh: Hiệu suất thu hồi protein (%)
Mi: Lượng chất khô có trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa ban đầu (g);
Mr: Lượng chất rắn còn sót lại sau quá trình tách chiết (g);
2.2.4.2. Xác định hàm lượng protein có trong dịch protein thu hồi được
Lượng protein có trong sản phẩm thô được xác định bằng phương pháp Bradford.
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein [33, 34].
Hình 2.2. Cơ chế tác dụng protein với dung dịch Bradford Protein
Pro-Dye Complex A = 595 nm
Blue
+
GVHD: ThS. Bùi Viết Cường SVTH: Trần Thị Thu Vân 25
Chuẩn bị dung dịch Braford: Cân 0,2 g Coomassie Brilliant Blue (G-250) hòa tan trong 100 mL dung dịch ethanol (95%) rồi thêm 200 mL axit phosphoric 85%. Hỗn hợp được trộn đều và pha loãng đến 2 lít trong bình định mức. Trước khi sử dụng, thuốc thử Bradford được lọc qua giấy lọc Whatman No.1 [33,34]. Trong phương pháp này, các protein có thể được phát hiện phải có trọng lượng phân tử lơn hơn 3000 Dalton, các protein nhỏ hơn, peptide và amino axit không thể phát hiện được [43].
Lấy 1 mL dịch thủy phân, pha loãng 100 lần trong bình định mức bằng nước cất.
Dung dịch sau pha loãng (1mL) được thêm 5mL dung dịch Bradford và lắc đều, sau đó giữ yên trong 5 phút để ổn định màu rồi tiến hành đo quang tại bước sóng 595 nm bằng máy UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh).
Mẫu trắng: Mẫu trắng gồm 1 mL nước cất + 5 mL dung dịch Bradford, làm tương tự như trên. Dung dịch albumin với các nồng độ khác nhau được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Phần trăm hiệu suất thu hồi protein có trong sản phẩm thô được xác định bằng công thức:
Hp (%) = p
o
M ×100%
M Trong đó: Hp là hiệu suất thu hồi protein (%)
Mp là khối lượng protein có trong dịch sản phẩm thô thu được (g);
Mo là khối lượng protein có trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa ban đầu (g);
2.2.4.3. Xác định hàm lượng axit amin trong dịch protein thu hồi được
Hàm lượng axit amin trong sản phẩm thô được xác định bằng phương pháp đồng [35]. Mẫu dịch protein thủy phân (5mL) cho vào bình định mức 50 mL, lấy 5 mL dịch đã pha loãng vào bình định mức 25 mL, thêm 2 giọt thymolphthalein 0,25% và nhỏ từng giọt NaOH 0,1N vào cho đến khi dung dịch có màu xanh nhạt da trời (pH=10), thêm 10 – 15 mL hỗn hợp đồng phốt phát rồi định mức bằng nước cất. Lắc đều, li tâm hoặc lọc qua giấy lọc cứng dày để thu dịch lọc trong suốt. Lấy 10 mL dịch lọc cho vào bình nón dung tích 100mL, thêm 5 giọt axit acetic (CH3COOH) đậm đặc và khoảng 0,2–0,5 g KI tinh thể, lắc đều, dung dịch có màu vàng của iôd. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,01 M cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt. Thêm 2 – 4 giọt dung dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh. Chuẩn độ tiếp cho đến khi dung dịch vừa mất màu.
Ghi lượng dung dịch natri thiosulfat 0,01 M dùng để chuẩn độ.
Chuẩn bị mẫu trắng: Lấy 5 mL nước cất thay cho 5 mL dịch protein thủy phân đã pha loãng và tiến hành tương tự như trên. Hàm lượng nitơ axit amin trong dịch protein
GVHD: ThS. Bùi Viết Cường SVTH: Trần Thị Thu Vân 26
được tính bằng g/l theo công thức sau:
(V1-V2) 0, 00028 10 25 1000
XAA ' 1, 4 (V1-V2)
5 10
= =
Trong đó:
V1 : thể tích natri thiosulfat 0,01M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử (mL);
V1 : thể tích natri thiosulfat 0,01M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (mL);
10 : độ pha loãng của
5 : thể tích dung dịch pha loãng
25: thể tích toàn bộ hỗn hợp dịch trước khi lọc (mL);
10: thể tích dung dịch lọc lấy xác định (mL);
0,00028 : số g nitơ axit amin tương ứng với 1mL dung dịch natri thiosulfat 0,01 M 1000: Hệ số tính ra g/l
Phần trăm hiệu suất thu hồi axit amin có trong dịch protein được xác định bằng công thức:
Haa (%) = aa
p
M ×100%
M [46]
Trong đó: Haa là hiệu suất thu hồi axit amin (%)
Maa là lượng axit amin có trong dịch sản phẩm thô (g);
Mo là khối lượng protein có trong cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (g);
2.2.4.4. Xác định độ hấp thụ màu của sản phẩm thô
Độ hấp thụ màu của sản phẩm thô được xác định ở bước sóng 284nm phản ánh cường độ của phản ứng Maillard và nồng độ các sản phẩm trung gian của phản ứng Maillard [36, 37].
Độ hấp thụ UV của sản phẩm thô thu được sau phản ứng chuyển hóa (pha loãng 100 lần) được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 284 nm bằng máy quang phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh) [36, 37].
Nước cất được sử dụng làm mẫu trắng.