Chương 2: KỸ THUẬT SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG
2.3. Các phương pháp nuôi cấy nấm mốc
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt 2.3.1.1.Môi trường dinh dưỡng
Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi cấy vi sinh vật là tính hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo amylase đều hấp thụ cacbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin,…), huydro ở dạng nước và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử..
Tổng hợp sự phân cắt của enzyme amylase lên tinh bột
Hàm lượng tinh bột trong môi trường nuôi cấy không được ít hơn 20÷23%.
Người ta thấy rằng khi hàm lượng tinh bột trong môi trường giảm đi thì hoạt độ của enzyme cũng sẽ giảm.
2.3.1.2.Độ ẩm của môi trường
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường đối với Aspergillus oryzae là 58÷70% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Nếu độ ẩm tăng quá mức này thì sẽ làm giảm độ thoáng khí của môi trường, còn thấp hơn thì sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo ra enzyme amylase. Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay) thì độ ẩm của môi trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dể bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (nhằm phòng ngừa và hạn chế sự hong khô của môi trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn vì khi bị hong khô thì hoạt lực của enzyme sẽ giảm đi rất nhiều. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích.
Cần thông khí trong suốt thời kí sinh trưởng của vi sinh vật. Trong quá trình sinh trưởng của mình, vi sinh vật tiêu thụ khoảng 25÷35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió với không khí vô trùng. Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Thường là ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4÷5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn ở giai đoạn thứ hai là 30÷60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1giờ, còn lại ở giai đoạn thứ ba giảm đi chỉ còn 10÷12 thể tích không khí mà thôi.
2.3.1.3.Nhiệt độ nuôi
Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc có thể chia làm ba thời kỳ
+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (10÷11 giờ đầu tiên). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi không thấp hơn 23÷30oC. Độ ẩm tương đối của không khí là 96÷100%.
+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4÷18 giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn.
Kết quả là trong lớp sợi nấm đang mọc, nhiệt độ sẽ tăng lên đến 37÷40oC, đôi khi tới 47oC. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi để sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28÷29oC và độ ẩm cao vào phòng nuôi.
+ Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10÷20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Aspergillus oryzae chỉ tạo được có 7,5÷8% enzyme, trong vòng 12 giờ sau, hoạt lực của α – amylase tăng 9÷12 lần, hoạt lực đường hóa tăng hai lần và hoạt lực của oligo – 1,6 – glucosidase tăng lên 10 lần. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3÷4oC so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên mối trường rắn là 28÷30oC.
2.3.1.4.Thời gian nuôi
Thời gian nuôi để vi sinh vật tạo ra lượng enzyme cao thường được xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzyme amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy bề sâu
2.3.2.1.Môi trường dinh dưỡng
Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy bề sâu người ta sẽ cho si sinh vật phát triển trong môi trường lỏng. Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích hợp cho mỗi chủng vi sinh vật sẽ khác nhau.
Trong nhiều trường hợp, môi trường để nuôi cấy bề sâu thường chứa tinh bột, các dạng bột và một số vật liệu khác làm nguồn cacbon. Chỉ một số ít chủng dùng nguồn cacbon là các đường dễ dàng đồng hóa như glucose. Thực tế, trong một số trường hợp người ta đường hóa sơ bộ tinh bột bằng amylase (trước khi thanh trùng). Khi đó maltose được tạo thành sẽ được đồng hóa tốt hơn và so với tinh bột, maltose là chất cảm ứng tốt hơn của enzyme đường hóa của nấm mốc.
Ngoài ra thể loãng của môi trường cuãng tốt hơn do độ nhớt của nó bị giảm xuống một cách sâu sắc.
2.3.2.2.pH của môi trường
Trị số pH ban đầu của môi trường cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần phải tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. Thông thường đối với α – amylase, pH tối ưu cho sinh tổng hợp là khoảng 7÷8, khác với pH tối ưu cho hoạt động của nó là khoảng 4,7÷4,9.
2.3.2.3.Sục khí và khuấy trộn
Sự sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng của mình, vi sinh vật sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong mối trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo mối trường có tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp các enzyme của vi sinh vật.
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi vi sinh vật (gồm nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) tạo enzyme có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo
môi trường bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt cả quá trình nuôi. Việc chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sự sinh tổng hợp enzyme amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10÷12 m3 không khí vô trùng (có nhiệt độ không quá 40oC) trên 1m3 môi trường trong một giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68÷72 giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống (48 giờ) và trong các thùng lên men sản xuất (48÷52 giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 phải là 30 m3/ m3 môi trường/giờ đối với thùng nhân giống và là 40 m3/ m3 môi trường/giờ đối với thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu trường để nuôi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi vi sinh vật ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi vi sinh vật ưa ẩm. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ tương đối cao (50÷65oC), độ hòa tan của oxy trong môi trường giảm xuống, mặc dù nhu cầu của vi sinh vật ưa nhiệt về oxy cho các phản ứng oxy hóa lại tăng lên.
Chương 3