2.1. Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu
Hình 2. 1. Bột đậu phộng thô Hình 2. 2. Bột đậu phộng mịn sau khi sử lý Bánh dầu đậu phộng được thu mua trên địa bàn thành phố Đà Nẵng và được nghiền nhỏ bằng máy nghiền gia dụng (National Mixer Grinder, MX-119N, Nhật Bản).
Sàng phân loại với đường kính lỗ sàng 0,25 mm được sử dụng để phân loại bột bánh dầu đậu phộng. Bột bánh dầu đậu phộng có kích thước 0,25 mm được bảo quản trong lọ kín quá trình nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng gồm: dung dịch acid clohydride 36%-38% (Trung Quốc), albumin, Acid phosphoric 85% (Trung Quốc), Coomassie Brilliant Blue (G250), cồn thực phẩm 96o (Việt Nam), ống chuẩn Natrithiosulfat, đồng clorua 99% (Trung Quốc), dung dịch Natriphosphat 99% (Na3PO4.12H2O) (Trung Quốc), Natri tetraborat 99,5%
(Na2B4O7.10H2O) (Trung Quốc), Acid acetic đậm đặc 99,5% (Trung Quốc), Kali iodid tinh thể 99% (Trung Quốc), Tinh bột (Trung Quốc), Themolphtalein (Trung Quốc).
2.2. Phản ứng thủy phân bột bánh dầu đậu phộng
Phản ứng thủy phân bột bánh dầu đậu phộng được thực hiện trong bình phản ứng kín bằng sứ chịu nhiệt và chịu áp suất (50 mL). Bột bánh dầu đậu phộng (1 g) được hòa trộn đều với dung dịch xúc tác HCl ở nồng độ và thể tích xác định theo từng phản ứng. Phản ứng thủy phân được thực hiện với lò sấy (101-2, Ketong, Trung Quốc). Sản phẩm thu được sau phản ứng thủy phân được làm nguội đến nhiệt độ phòng và lọc qua giấy lọc (Whatman No.1). Dịch lọc được bảo quản ở 4°C cho các phân tích tiếp theo. Chất rắn
còn sót lại trên giấy lọc được sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 100°C để xác định hiệu suất thủy phân.
2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến phản ứng thủy phân bột bánh dầu đậu phộng
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Phản ứng thủy phân bột bánh dầu đậu phộng được thực hiện ở tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl 1:20 (w:v); nồng độ xúc tác HCl 0,1 M; thời gian phản ứng 20 phút và nhiệt độ phản ứng trong khoảng 40 - 200°C (khoảng cách giữa 2 lần khảo sát là 20°C)
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl
Nhiệt độ phản ứng tối ưu; nồng độ xúc tác HCl 0,1 M; thời gian phản ứng 20 phút được sử dụng để thủy phân bột bánh dầu đậu phộng với tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl từ 1:20 đến 1:50 (w:v), chênh lệch thể tích xúc tác HCl giữa hai điểm khảo sát 5 mL.
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác HCl
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ xúc tác HCl đối với phản ứng thủy phân bột bánh dầu đậu phộng được thực hiện ở nhiệt độ phản ứng và tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác NaOH tối ưu, thời gian phản ứng 30°C và nồng độ xúc tác HCl trong khoảng 0,05 M đến 0,35 M (khoảng cách giữa hai điểm khảo sát 0,05 M).
2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Điều kiện tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ cơ chất:thể tích xúc tác HCl, nồng độ xúc tác HCl) cùng với thời gian phản ứng trong khoảng 10 đến 60 phút (chênh lệch thời gian phản ứng giữa hai điểm khảo sát 10 phút) được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến phản ứng thủy phân bột bánh dầu đậu phộng nhằm thu dịch protein thủy phân bằng sự kết hợp giữa nhiệt và xúc tác HCl.
2.4. Phương pháp phân tích
2.4.1. Xác định thành phần hóa học tương đối của bột bánh dầu đậu phộng Thành phần hóa học tương đối của bột bánh dầu đậu phộng (protein, carbohydrat, lipid, tro tổng và ẩm) được xác định theo phương pháp chuẩn của Cộng đồng phân tích (AOAC) [30].
2.4.2. Xác định hiệu suất thủy phân
Hiệu suất thủy phân được xác định theo công thức:
𝐻ℎ = (𝑀𝑖−𝑀𝑟
𝑀𝑖 ) × 100% (1) Trong đó:
Mi là lượng chất khô có trong bột bánh dầu đậu phộng (g), Mr là lượng chất rắn còn lại sau phản ứng thủy phân (g), Hh là hiệu suất thủy phân (%).
2.4.3. Xác đinh hàm lượng protein của mẫu khảo sát
Hàm lượng protein được xác đinh bằng phương pháp Bradford [32, 33]. Cách chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G-250): cân 0,2 g G-250 và hòa tan trong 100 mL dung dịch ethanol (95%), sau đó thêm vào thuốc thử Bradford 200 mL acid phosphoric 85%. Hỗn hợp được trộn đều và pha loãng đến 2L trong bình định mức. Trước khi sử dụng, thuốc thử Bradford được lọc qua giấy lọc Whatman No.1.
Trong phương pháp này, các protein có thể được phát hiện phải có trọng lượng phân tử lơn hơn 3000 Dalton, các protein nhỏ hơn, peptide và amino acid không thể phát hiện được.
Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (0,1 mL) được pha loãng và định mức 10mL bằng nước cất. Dung dịch sau pha loãng (1 mL) được thêm 5 mL dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G-250) trong ống nghiệm và lắc đều, sau đó giữ yên trong 5 phút để ổn định màu. Đo độ hấp phụ của hỗn hợp tại bước song 595 nm bằng quán phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh). Hỗn hợp gồm nước cất và thuốc nhuộm G-250 theo tỉ lệ (1:5, v/v) được dùng làm mẫu trắng. Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của dịch mẫu khảo sát suy ra hàm lượng protein Mpc
(àg/mL) cú trong Mpm (g) nguyờn liệu.
Hình 2. 3. Phản ứng tạo phức màu giữa protein và Coomasie Brilliant Blue G-250 [31]
Hiệu suất thu hồi protein được tính theo công thức:
𝐻𝑝 = (𝑀𝑝𝑚−𝑀𝑝𝑐
𝑀𝑝𝑚 ) × 100% (2) Trong đó:
Protein + Blue
Pro-Dye Complex A = 595 nm
Mpm là lượng protein có trong bột bánh dầu đậu phộng (g),
Mpc là lượng protein có trong dịch sản phẩm thô thu được sau phản ứng thủy phân (g), Hp là hiệu suất thu hồi protein (%).
2.4.4. Xác định hàm lượng acid amin của mẫu khảo sát
Acid amin của sản phẩm thô được xác định bằng phương pháp đồng được xây dựng bởi C.P. Pope và M.F. Stevens [34].
Cách chuẩn bị dung dịch đồng phosphate: Dung dịch đồng cloric (A) cân 27,3 g CuCl2 (hoặc 35,4 g CuCl2.2H2O) hòa tan tròn 1 L nước; Dung dịch natri phosphate (B):
68,5 g Na3PO4.12H2O hòa tan trong 1 L dung dịch (hoặc 64,5 g Na2HPO4 hòa tan trong 500 ml nước cất đun sôi để nguội, thêm 7,2 g NaOH và định mức đến 1 L bằng nước cất đun sôi để nguội); Dung dịch đệm borat pH 8,8 (C): 28 g natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) hòa tan trong 750 mL nước cất. Thêm 50 mL dung dịch HCl 0,1 N và thêm nước cất đến 1 L. Trộn lẫn các dung dịch trên theo tỉ lệ A:B:C = 1:2:2, thu được hỗn hợp đồng phosphate. Cho dung dịch A trộn với dung dịch B, lắc đều rồi cho thêm dung dịch C.
Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (1 mL) được pha loãng định mức 10 mL bằng nước cất. Dung dịch sau pha loãng (5 mL) cho vào bình định mức (25 mL) rồi thêm 2 giọt themolphtalein (0,25%) và thêm từng giọt natri hydroxit (0,1 N) vào cho đến khi dung dịch có màu xanh da trời nhạt. Sau đó thêm 10 – 15 mL hỗn hợp đồng phosphate, rồi thêm nước cất đến vạch. Lắc đều, lọc qua giấy lọc để thu dịch trong. Dịch lọc (10 mL) cho vào bình tam giác, thêm 5 giọt acid acetic đậm đặt và 0,2 – 0,5 g kali iodid tinh thể rồi lắc đều, dung dịch có màu vàng. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate (0,01 M) đến khi dung dịch có màu vàng nhạt. Thêm 2 – 4 giọt dung dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh tím. Chuẩn độ tiếp đến khi dung dịch mất màu. Ghi thể tích dung dịch natri thiosulfate 0,01 M đã dùng để chuẩn độ. Lấy 5 mL nước cất thay cho 5 mL dung dịch mẫu pha loãng và tiến hành như trên làm mẫu trắng. Từ thể tích Na2S2O3 0,01 M đã chuẩn độ suy ra hàm lượng acid amin.
Hiệu suất thu hồi acid amin được tính theo công thức:
𝐻𝑎𝑎 = 𝑀𝑎𝑎
𝑀𝑝𝑚× 100% (3) Trong đó:
Maa là lượng acid amin có trong sản phẩm thô thu được sau phản ứng thủy phân (g), Mpm là lượng protein có trong bột bánh dầu đậu phộng (g),
Haa là hiệu suất thu hồi protein (%).
2.4.5. Độ hấp thụ của sản phẩm thô sau phản ứng
Độ hấp thụ của sản phẩm thô được xác định ở bước sóng 284 nm phản ánh cường độ của phản ứng caramel, Maillard và các sản phẩm trung gian của phản ứng Maillard [33]. Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (pha loãng 200 lần) được xác định bằng cách đo độ hấp phụ quang tại bước sống 284 nm bằng máy quang phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh) [32, 35]. Nước cất được sử dụng làm mẫu trắng.
2.4.6. Phương pháp tính toán và phân tích số liệu
Sự khác biệt có ý nghĩa của hiệu suất thu hồi protein thủy phân từ bột bánh dầu đậu phộng được xác định bằng phân tích phương sai ANOVA - One way [36] với phần mềm Minitab 16.