CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Các phương pháp phân tích
2.3.1. Xác định thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa
Thành phần hóa học tương đối của cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (ẩm, protein, lipid, tro) được phân tích bằng phương pháp chuẩn của Cộng đồng phân tích quốc tế AOAC [32].
2.3.1.1. Xác định hàm lượng ni-tơ tổng số và protein thô của cơ thịt đỏ cá ngừ.
Hàm lượng protein thô trong mẫu được xác định bằng phương pháp xác định hàm lượng ni-tơ tổng số - phương pháp Kjeldahl. Vô cơ hóa mẫu bằng acid sulfuric đậm đặc, ni-tơ có trong mẫu sẽ chuyển thành amon sulfat. Dùng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sulfat trong máy cất đạm tạo thành amon hydroxyt, sau đó định lượng bằng acid. Hàm lượng ni-tơ trung bình trong phân tử protein của sản phẩm thủy sản là 16%
vì vậy hàm lượng protein thô trong mẫu thử bằng hàm lượng ni-tơ tổng số nhân với hệ số 6,25. Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.1 phụ lục 2.
2.3.1.2. Xác định hàm lượng chất béo thịt đỏ cá ngừ
Hàm lượng chất béo được xác định dựa theo phương pháp chiết Soxhlet theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.2 phụ lục 2. Mẫu được xử lý bằng natri sulfat hoặc canxi sulfat,
chất béo giải phóng được trích ly bằng ete etylic. Dung môi được làm bay hơi và lượng chất béo được xác định bằng cách cân.
2.3.1.3. Xác định hàm lượng tro tổng số thịt đỏ cá ngừ
Tro hóa hoàn toàn mẫu trong lò nung ở nhiệt độ từ 500 đến 550oC, thời gian 4 – 6h trong lò nung để chuyển hóa hoàn toàn chất hữu cơ thành tro có màu xám trắng. Hàm lượng tro được xác định từ khối lượng tro còn lại sau khi tro hóa. Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.3 phụ lục 2.
2.3.1.4. Xác định hàm lượng ẩm thịt đỏ cá ngừ
Dùng nhiệt để loại bỏ nước khỏi mẫu thử. Hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử. Quy trình được tiến hành theo tiêu chuẩn AOAC ở mục 2.4 phụ lục 2.
2.3.2. Xác định hiệu suất thủy phân
Mẫu sau phản ứng được lọc bằng phễu lọc Bucher để thu hồi dịch lọc. Lượng cá sau lọc được đem đi sấy ở 100oC đến khi khối lượng không đổi. Sau đó đem cân rồi trừ cho khối lượng giấy lọc để thu được khối lượng còn lại sau phản ứng thủy phân.
Hiệu suất thủy phân được tính theo công thức:
H%= M1 − M2
M2 ×100 Trong đó:
M1: Khối lượng chất khô của cá trước khi phản ứng M2: Khối lượng chất khô của cá sau khi phản ứng 2.3.3. Xác đinh hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác đinh bằng phương pháp Bradford [33]. Cách chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G-250): cân 0,2 g G-250 và hòa tan trong 100 mL dung dịch ethanol (95%), sau đó thêm vào thuốc thử Bradford 200 mL acid phosphoric 85%. Hỗn hợp được trộn đều và pha loãng đến 2 L trong bình định mức. Trước khi sử dụng, thuốc thử Bradford được lọc qua giấy lọc Whatman No.1 [33]. Trong phương pháp này, các protein có thể được phát hiện phải có trọng lượng phân tử lơn hơn 3000 Da, các protein nhỏ hơn, peptide và amino acid không thể phát hiện được [34].
Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (0,1 mL) được pha loãng đến 10 mL bằng nước cất. Dung dịch sau pha loãng (1 mL) được thêm 5 mL dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G-250) trong ống nghiệm và lắc đều, sau đó giữ yên trong 5 phút để ổn định màu. Đo độ hấp phụ của hỗn hợp tại bước song 595 nm bằng quán phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh). Hỗn hợp gồm nước cất
và thuốc nhuộm G-250 theo tỉ lệ (1:5, v:v) được dùng làm mẫu trắng. Dung dịch albumin với các nồng độ khác nhau được dùng để xây dựng đường chuẩn. Hàm lượng protein được tính toán bằng % (g protein trong 100 g trọng lượng khô của thịt đỏ cá ngừ).
Hình 2.1. Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250
Hình 2.2. Phản ứng tạo phức màu giữa protein và Coomasie Brilliant Blue G-250 Hiệu suất thu hồi protein được tính theo công thức:
H%= M1
M2 ×100 Trong đó:
M1: Khối lượng protein có trong dịch protein thủy phân thô (g)
M2: Khối lượng protein tổng có trong mẫu cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (g) 2.3.4. Xác định hàm lượng acid amin
Hàm lượng acid amin được xác định bằng phương pháp đồng [35]. Cách chuẩn bị dung dịch đồng phosphate: dung dịch đồng cloric (A) cân 27,3 g CuCl2 (hoặc 35,4 g CuCl2.2H2O) hòa tan tròn 1 L nước. Dung dịch natri phosphate (B): 64,5 g Na3PO4.12H2O hòa tan trong 1 L dung dịch (hoặc 64,5 g Na2HPO4 hòa tan trong 500 mL nước cất đun sôi để nguội, thêm 7,2 g NaOH và định mức đến 1 L bằng nước cất đun sôi để nguội). Dung dịch đệm borat pH 8,8 (C): 28 g natri tetraborat
Protein + Blue
Pro-Dye Complex A = 595 nm
(Na2B4O7.10H2O) hòa tan trong 750 mL nước cất. Thêm 50 mL dung dịch HCl 0,1N và thêm nước cất đến 1 L. Trộn lẫn các dung dịch trên theo tỉ lệ: A:B:C = 1:2:2, thu được hỗn hợp đồng phosphate. Cho dung dịch (a) trộn với dung dịch (b), lắc đều rồi cho thêm dung dịch (C) [15].
Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (2,5 mL) được pha loãng đến 200 mL bằng nước cất. Dung dịch sau pha loãng (5 mL) cho vào bình định mức (25 mL) rồi thêm 2 giọt thimolphtalein (0,25%) và thêm từng giọt natri hydroxit (0,1 N) vào cho đến khi dung dịch có màu xanh da trời nhạt. Sau đó thêm 10 – 15 mL hỗn hợp đồng phosphate, rồi thêm nước cất đến vạch. Lắc đều, lọc qua giấy lọc để thu dịch trong. Dịch lọc (10 mL) cho vào bình tam giác, thêm 5 giọt acid acetic đậm đặt và 0,2 – 0,5 g kali iodid tinh thể rồi lắc đều, dung dịch có màu vàng. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate (0,01 M) đến khi dung dịch có màu vàng nhạt. Thêm 2 – 4 giọt dung dịch tinh bột 1%, dung dịch có màu xanh tím. Chuẩn độ tiếp đến khi dung dịch mất màu. Ghi lượng dung dịch natri thiosulfate 0,01 M đã dùng để chuẩn độ. Lấy 5 mL nước cất thay cho 5 mL dung dịch mẫu pha loãng và tiến hành như trên làm mẫu trắng.
Hàm lượng acid amin trong mẫu được tính bằng g/mL theo công thức:
XAA'= (V1−V2)×0,00028 ×10 ×25 2,5 ×10
Trong đó:
V1: Thể tích natri thiosulfate 0,01 M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử (mL) V2: Thể tích natri thiosulfate 0,01 M tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng (mL) 10: Độ pha loãng mẫu
5: Thể tích dung dịch pha loãng
25: Thể tích toàn bộ hỗn hợp dịch trước khi lọc (mL) 10: Thể tích dung dịch lọc lấy để chuẩn độ (mL)
0,00028: Số g nitơ acid amin tương ứng với 1 mL dung dịch natri thiofulfat 0,01 M H%= Maa
Mp ×100 Trong đó:
Maa: Khối lượng của acid amin có trong dịch protein thủy phân thô (g).
Mp: Khối lượng protein tổng có trong mẫu cơ thịt đỏ cá ngừ sọc dưa (g) 2.3.5. Độ hấp thụ của sản phẩm thô sau phản ứng
Độ hấp thụ UV của sản phẩm thô tại bước sóng 284 nm phản ánh cường độ của phản ứng Maillard và sự hình thành các sản phẩm trung gian. Sản phẩm thô thu được sau phản ứng (pha loãng 100 lần) được xác định bằng cách đo độ hấp phụ quang tại
bước sống 284 nm bằng máy quang phổ UV-VIS (Jenway spectrophotometer 6305, Vương quốc Anh). Nước cất được sử dụng làm mẫu trắng [33, 36, 37].
2.3.6. Phương pháp tính toán và phân tích số liệu
Phần mềm Minitab 17 được sử dụng để phân tích phương sai ANOVA – One Way cho sự khác biệt có ý nghĩa nhằm lựa chọn điều kiện tối ưu cho từng yếu tố ảnh hưởng.