7.1. Giới thiệu
Hầu hết các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sống là: carbohydrate, protein, lipid hoặc axit nucleic. Các tiểu đơn vị của các đại phân tử này và các nhóm đặc trưng này truyền các tính chất hoá học khác nhau cho các đại phân tử. Sử dụng xét nghiệm sinh hoá để xác định hợp chất chưa biết. Đối chứng dương chứa biến đang thử nghiệm, nó phản ứng dương tính và đối chứng âm không chứa biến đang tìm kiếm, nó chỉ ứa dung môi và không phản ứng trong thử nghiệm, cho ch biết kết quả âm tính. Sử dụng sắc ký để tách hỗn hợp. Hỗn hợp được hoà tan trong chất lỏng di chuyển qua ma trận làm từ các vật liệu như hạt, giấy, gel chuyển động với tốc độ khác nhau làm chúng tách rời nhau. Các chất có thể được phân tách bằng cách phân chia chúng giữa pha tĩnh và pha động của sắc ký giấy. Mục đích của thí nghiệm:
• Thực hi n các xét nghiệ ệm định tính để phát hiện s hi n di n c a carbohydrat, protein, ự ệ ệ ủ lipid và s c t quan tr ng v m t sinh h c ắ ố ọ ề ặ ọ
• Giải thích t m quan tr ng của mầ ọ ột đối chứng dương tính và âm tính trong các xét nghiệm sinh hoá
• Sử ụ d ng các xét nghiệm sinh hoá để xác định m t hợp chộ ất chưa biết
• Giải thích cách sử d ng s c ký giụ ắ ấy để tách các hợp ch t hấ ữu cơ ra khỏ ỗn hợp i h
• Sử ụ d ng sắc ký giấy để tách các hợp ch t hấ ữu cơ ra khỏi hỗn hợp
7.2. Quy trình
7.2.1. Quy trình 1: Xác định đường khử bằng phả ứng Fehlingn
Bước 1: Lấy 3 mL mẫu đã cho vào ống nghiệm khô, s ch. Nạ ồng độ ủa các m u th ph i là 5% c ẫ ử ả (w/v).
Bước 2: Thêm khoảng 2-3 gi t thu c th ọ ố ử Fehling’s vào mỗi ống nghi m và tr n b ng cách xoay ệ ộ ằ
ống nghi m. ệ
Bước 3: Giữ các ng nghi m trong b cách thu kho ng 1-2 phút. ố ệ ể ỷ ả
Bước 4: Quan sát và ghi lạ ựi s xu t hi n c a màu s c trong các ng nghi m. ấ ệ ủ ắ ố ệ
7.2.2. Quy trình 2: Phản ứng Xanthoproteic
Bước 1: Lấy 5 ng nghi m số ệ ạch và để trên khay đựng.
Bước 2: Cho 2 mL dung d ch m u vào trong ng nghiị ẫ ố ệm.
Bước 3: Cho 2 mL nitric acid đậm đặc thêm vào mỗi ống nghiệm (có thể xuất hiện kết tủa
trắng).
Bước 4: Dùng kẹ ốp ng nghi m gi ng nghiệ ữ ố ệm và đun nhẹ trên lửa đèn cồn đến khi dung d ch ị trong.
Bước 5: Để ngu i ng nghiộ ố ệm đến nhiệt độ phòng.
Bước 6: Cho 1 mL dung d ch NaOH 30% vào mị ỗi ống nghi m và quan sát s chuy n màu. ệ ự ể
7.2.3. Quy trình 3: Phản ứng Sudan III
Bước 1: Lấy 5 ng nghi m số ệ ạch và để trên khay đựng.
Bước 2: Cho 2 mL nước cất vào mỗi ống nghiệm.
Bước 3: Cho 1 mL m u vào ng nghiẫ ố ệm.
Bước 4: Nhỏ 2-3 gi t dung dịch Sudan II vào m i ống nghi m, lọ ỗ ệ ắc đều và quan sát.
7.2.4. Quy trình 4: S c ký giắ ấy xác định thành ph n s c t quang h p ầ ắ ố ợ
Bước 1: Nhận m t giấy s c ký phòng thí nghi m c a b n. X lý gi y theo các c nh cộ ắ ệ ủ ạ ử ấ ạ ủa nó để dầu trên ngón tay c a b n không làm b n giủ ạ ẩ ấy.
Bước 2: Dùng pipet Pasteur để bôi một dải chiếc xuất thực vật cách đầu tờ giấy khoảng 2 cm. Để khô vi t s c và l p l i ít nh t 10 l n. ế ọ ặ ạ ấ ầ
Bước 3: Cho gi y s c ký vào ng nghi m chấ ắ ố ệ ứa 2 mL dung môi pha động. Đặt gi y s c ký sao ấ ắ cho đầu dải (nhưng không phải đầu dải của dịch chiết thực vật) ngập trong dung môi. B n có th ạ ể làm điều này bằng cách móc dải giấy b ng m t chi c ghim cằ ộ ế ắm vào nút đậy của ống.
Bước 4: Giữ cho cốc đậy kín và không bị xáo tr n trong quá trình di chuyển của dung môi. ộ
Bước 5: Lấy d i s c ký ra khi mả ắ ặt trước của dung môi cách đầu d i trong vòng 1 cm (t c là sau ả ứ 2-3 phút). Đánh dấu vị trí của dung môi phía trước bằng bút chì và đặt dải sang một bên để khô.
Bước 6: Dùng thước để đo khoảng cách t g c s c t ừ ố ắ ố đến trước dung môi và t g c n t ng dừ ố đế ừ ải sắc t . Tính s Rf cho m i s c t . ố ố ỗ ắ ố
7.3. Kết quả
7.3.1. Xác định đường khử bằng phả ứng Fehlingn
Ống nghi m t trái sang phệ ừ ải: glucose, giá, đậu xanh, tinh
bột, nước cất
7.3.2. Phả ứng Xanthoproteicn
Ống nghi m t trái sang ph i: d u th c vật, nước ệ ừ ả ầ ự
cất, đậu trắng, mật ong, tyrosine, đậu xanh
7.3.3. Phả ứng Sundan IIIn
Có l p chớ ất màu đỏ ổ n i lên ph n trên ng nghi m. ng ầ ố ệ Ố nghiệm chia thành hai phần: phần nước và phần hỗn h p. ợ
7.3.4. Sắc ký giấy xác định thành phần sắc tố quang
hợp
Khoảng cách từ vị trí ban đầu đến Carotene (vạch vàng)
là 2,8cm
Khoảng cách từ vị trí ban đầu đến chlorophyl a (vạch
xanh lá) là 2,5cm
Khoảng cách di chuyển từ ấm ban đầu đến pha rộng là ch
2,8 cm
7.4. Thảo luận và giải thích kết quả
7.4.1. Xác định đường khử bằng phả ứng Fehlingn
• Ống nghi m glucose chuyển sang màu cam là do ion copper b kh trong ph c ch t và ệ ị ử ứ ấ không t o k t t a ch ng t glucose ạ ế ủ ứ ỏ là đường kh . ử
• Ống nghi m chệ ứa giá và đậu xanh có lượng đường ít hơn.
• Ống nghi m tinh bệ ột và nước cất không có hiện tượng xảy ra do không phải đường kh . ử
7.4.2. Phản ứng Xanthoproteic
• Ống nghiệm nước đậu tr ng và ng nghi m lòng tr ng trắ ố ệ ắ ứng đều không đổi màu ch ng minh do ứ không ph i là amino acid có chả ứa nhóm thơm như tyrosine và tryptophan.
• Ống nghi m lòng tr ng tr ng xu t hi n kệ ắ ứ ấ ệ ết t a do ph n ủ ả ứng v i HNO . ớ 3
7.4.3. Phả ứng Sundan IIIn
• Do h n hỗ ợp sudan III và lysochrome bám vào đậu phộng có lipid chuyển thành màu đỏ, dầu thực vật cũng bị Sundan III nhuộm đỏ nhẹ hơn nước nên nổi lên phần trên.