2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng dược liệu [7]
2.2.1.1. Độ ẩm theo PL 9.6 DĐVN IV (thực hiện với 03 mẫu thử) Dụng cụ làm bì: Cốc thủy tinh miệng rộng, đáy bằng, có nắp mài.
Cách tiến hành: Làm khô bì trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 1050C bằng tủ sấy quạt gió đối lưu, làm nguội bì trong bình hút ẩm, cân bì ghi khối lượng bì. Cân 2 g dược liệu đã được nghiền nhỏ vào bì, dàn mỏng mẫu thử. Sấy mẫu thử ở 1050C trong 2 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, xác định khối lượng mẫu thử sau sấy lần 1. Tiếp tục sấy lần 2 với điều kiện như trên trong 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, xác định khối lượng sau sấy mẫu thử lần 2. Độ chênh lệch khối lượng giữa 2 lần không quá 0,5 mg.
Tính độ giảm khối lượng của từng mẫu thử (khối lượng sau sây/khối lượng trước sấy). Lấy trung bình 3 mẫu ta có kết quả cần tìm.
2.2.1.2. Tro toàn phần theo PL 9.8 DĐVN IV (thực hiện với 03 mẫu thử)
Cách tiến hành: Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong vòng 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1 g mẫu thử rải đều trong chén nung, sấy 1 giờ ở 1000C đến 1050C rồi đem nung trong lò nung ở 6000C ± 250C đến khi tạo thành tro trắng, lấy chén nung kèm tro làm nguội trong mình hút ẩm rồi cân. Dùng nước nóng lấy cắn, lọc qua giấy lọc không tro, rồi nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi. Cân lần cuối, xác định khối lượng còn lại, tính tỉ lệ so với mẫu thử. Lấy trung bình cộng 3 mẫu ta được kết quả cần tìm.
2.2.1.3. Tạp chất theo PL 12.11 DĐVN IV (thực hiện với 03 mẫu thử)
Cân 1 g mẫu thử, dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp, khi cần rây để tách tạp chất và dược liệu.
Cân phần tạp chất và tính phần trăm như sau:
Trong đó: X% : Tỉ lệ tạp chất
a: Khối lượng tạp chất tính bằng gam p: Khối lượng mẫu thử tính bằng gam
2.2.1.4. Chất chiết được trong dược liệu theo PL 12.10 DĐVN IV (thực hiện với 03 mẫu thử)
Dung môi chiết: Ethanol 96%
Cách tiến hành: Cân 2 g bột dược liệu vào bình nón 250mL.
Thêm 100mL ethanol 96% vào bình, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh
thoảng lắc trong 6 giờ đầu, để yên trong 18 giờ. Lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy 20 mL cho vào một cốc thủy tinh đã cân bì, cô cách thủy đến cắn khô. Sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn sau cấy, tín phần trăm chất chiết được bằng ethanol theo dược liệu khô. Lấy trung bình cộng 3 mẫu, ta có kết quả cần tìm.
2.2.1.5. Định tính dược liệu bằng sắc kí lớp mỏng
Cỏ xước
Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 30 mL cồn 96%
chiết nóng 30 phút, lọc. Cô dịch chiết đến cắn. Hòa tan cắn trong 10 mL methanol. Lọc, thu dịch methanol chấm sắc ký.
Dung dịch đối chiếu:
- Cỏ xước chuẩn do Ban Nghiên cứu khoa học và thư viện – Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh cung cấp.
- Chiết như mẫu thử.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Ethylacetat – Nước – Aid formic (8 : 1: 1) Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn.
Lá lốt
Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 30 mL cồn 96%
chiết nóng 30 phút, lọc. Cô dịch chiết đến cắn. Hòa tan cắn trong 10 mL methanol. Lọc, thu dịch methanol chấm sắc ký.
Dung dịch đối chiếu:
- Lá lốt chuẩn do Ban Nghiên cứu khoa học và thư viện – Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh cung cấp.
- Chiết như mẫu thử.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Cloroform – Methanol (50 : 9)
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: UV 365 nm.
Mắc cỡ
Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu chiết siêu âm với 30 mL cloroform trong 15 phút, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Cắn thêm vào 10 mL methanol. Lấy dịch methanol chấm sắc ký.
Dung dịch đối chiếu:
- Mắc cỡ chuẩn do Ban Nghiên cứu khoa học và thư viện – Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh cung cấp.
- Chiết như mẫu thử.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Toluen - Ethylacetat (3 : 1)
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: Dung dịch UV 365 nm.
Sài đất
Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 30 mL ethanol 96% trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Hòa cắn trong 10 mL methanol. Lọc, thu dịch methanol chấm sắc ký.
Dung dịch đối chiếu:
- Dược liệu Sài đất chuẩn do Ban Nghiên cứu khoa học và thư viện – Khoa Dược – Đai học Y Dược TP.àà cung cấp.
- Chiết như mẫu thử.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Toluen – Ethylacetat – Acid formic (5 : 4 : 1)
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: UV 365 nm.
2.2.2. Phương pháp bào chế và kiểm tra chất lượng cao
Bã dược liệu 6L dịch chiết 1 2000g dược liệu, rửa sạch, chia nhỏ, để ráo
10 L nước sạch, ngâm 1h Đun sôi 1000C trong 2h
8 L nước sạch
Đun sôi 1000C trong 1h 30 phút
4 L dịch chiết 2 Bã dược liệu
Cao lỏng PT5
Cao đặc PT5 Cô cách thủy ở 800C
2.2.2.1. Quy trình bào chế
2.2.2.2. Kiểm tra chất lượng cao [7]
Độ ẩm theo PL 9.6 DĐVN IV Dụng cụ làm bì: Chén sứ
Cách tiến hành: Làm khô bì trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 1050C bằng tủ sấy quạt gió đối lưu, làm nguội bì trong bình hút ẩm, cân bì ghi khối lượng bì. Cân 2g dược liệu đã được nghiền nhỏ vào bì, dàn mỏng mẫu thử. Sấy mẫu thử ở 1050C trong 2 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, xác định khối lượng mẫu thử sau sấy
lần 1. Tiếp tục sấy lần 2 với điều kiện như trên trong 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, xác định khối lượng sau sấy mẫu thử lần 2. Độ chênh lệch khối lượng giữa 2 lần không quá 0,5 mg.Tính độ giảm khối lượng của từng mẫu thử (khối lượng sau sây/khối lượng trước sấy). Lấy trung bình 3 mẫu ta có kết quả cần tìm.
Tro toàn phần theo PL 9.8 DĐVN IV
Cách tiến hành: Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong vòng 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1 g mẫu thử rải đều trong chén nung, sấy 1 giờ ở 1000C đến 1050C rồi đem nung trong lò nung ở 6000C ± 250C đến khi tạo thành tro trắng, lấy chén nung kèm tro làm nguội trong mình hút ẩm rồi cân. Dùng nước nóng lấy cắn, lọc qua giấy lọc không tro, rồi nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi. Cân lần cuối, xác định khối lượng còn lại, tính tỉ lệ so với mẫu thử theo công thức:
Trong đó
A (%): Độ tro c (g): Khối lượng cao sử dụng
a (g): Khối lượng chén có tro
sau nung h (%): Độ ẩm cao
b (g): Khối lượng chén không
Tro tan trong acid theo PL 9.7 DĐVN IV tro
Cho 25 mL dung dịch acid hydrocloric 2M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vòa một phễu thủy tinh xốp đã cân bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 5000C đến khối lượng
không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã khô trong không khí.
Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
Kiểm tra đối chiếu cao chiết với các dược liệu nguyên liệu.
Chuẩn bị mẫu thử cao: Lấy 1 g cao thuốc đun cách thủy với 20 mL ethanol 96% trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Hòa cắn trong 10 mL methanl. Siêu âm, lọc, thu dịch lọc (dịch A) làm dung dịch thử chấm sắc ký.
Kiểm tra các thành phần của dược liệu Mắc cỡ có trong cao thuốc
Dung dịch thử: Lấy 0,25 g bột dược liệu chiết siêu âm với 30 mL cloroform trong 15 phút, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Cắn thêm vào 10 mL methanol. Lấy dịch methanol chấm sắc ký.
Dung dịch đối chiếu: Dịch A
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Toluen - Ethylacetat (3 : 1)
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: Dung dịch UV 365 nm.
Kiểm tra các thành phần của dược liệu Cỏ xước có trong cao thuốc
Dung dịch thử: Dung dịch A.
Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 30 mL cồn 96% chiết nóng 30 phút, lọc. Cô dịch chiết đến cắn. Hòa tan cắn trong 10 mL methanol. Lọc, thu dịch methanol chấm sắc ký.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Ethylacetat – Nước – Aid formic (8 : 1: 1) Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong cồn.
Kiểm tra các thành phần của dược liệu Lá lốt có trong cao thuốc
Dung dịch thử: Dung dịch A
Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 30 mL ethanol 96% trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Hòa cắn trong 10 mL methanol. Lọc, thu dịch.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Cloroform - Methanol(50 : 9)
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: UV 365 nm.
Kiểm tra các thành phần của dược liệu Sài đất có trong cao thuốc
Dung dịch thử: Dung dịch A
Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,25 g bột dược liệu đun cách thủy với 30 mL ethanol 96% trong 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Hòa cắn trong 10 mL methanol. Lọc, thu dịch.
Bản mỏng: Silica gel 60 F265 – Merck.
Dung môi khai triển: Toluen – Ethylacetat – Acid formic (5 : 4 : 1)
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký, làm khô bản mỏng.
Phát hiện: UV 365 nm.
2.2.3. Phương phỏp thử độc tớnh cấp (theo dừi độc tớnh cấp và xác định LD50 của cao đặc PT5 theo công thức Karber – Behrens) [14]
Điều kiện thí nghiệm
Thuốc thử nghiệm: Cao PT5 được hòa tan trong nước cất.
Dụng cụ thí nghiệm: Kim đầu tù để cho uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha thuốc.
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chuột đực mua về được nuôi ổn định khoảng 1 tuần trước thí nghiệm, được cung cấp đủ khẩu phần ăn và nước uống. Cho nhịn đói 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm, nước uống bình thường.
Đường dùng thuốc: đường uống (p.o.) Thể tích thuốc: 20 mL/kg thể trọng.
Số lần dùng thuốc: Dùng một lần duy nhất trong một ngày trong khoảng thời gian từ 8-9 giờ sáng.
Phương pháp thử
Để thăm dò liều ban đầu phải thực hiện qua 2 giai đoạn:
• Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều là 6 chuột).
• Giai đoạn xỏc định: Phải theo dừi cỏc lụ thật chặt chẽ trong 72 giờ đầu. Sau đú nếu cần thiết phải theo dừi 2 tuần tiếp theo.
- Thử nghiệm sơ khởi
Dùng 6 con chuột với một liều nào đó, thể tích là 20 mL/kg thể trọng. Nếu kết quả chết 6 con thì thăm dò với 6 con khác với liều giảm một nửa. Nếu cả 6 con đều sống thì thăm dò 6 con khác với liều tăng lên gấp đôi
Thăm dò như vậy cho đến khi tìm được một liều làm chết 50%
con vật thì lấy liều đó làm liều cơ sở, rồi dùng liều lớn hơn theo bước nhảy liều cho đến một liều làm chết tất cả các con vật thử
nghiệm và dùng một số liều nhỏ hơn theo bước nhảy liều cho đến khi thấy một liều làm tất cả các con vật thí nghiệm đều sống. Từ đó ta sẽ tìm được:
• Liều tối đa dung nạp: Không có con vật chết (d1).
• Liều tối thiểu làm chết tất cả các con vật thí nghiệm (d2) d1, d2 là giới hạn khoảng cách mà từ đó ta phải tìm những liều để thử nghiệm xác định
- Thử nghiệm xác định
Dùng khoảng 6 lô, mỗi lô 10 chuột. Ở những liều gần LD50
nên tăng số lượng động vật để đo lường được chính xác hơn. Liều ở khoảng cách (d1) và (d2) nên chọn cấp số nhân. Quan sát động vật trong 72 giờ sau khi uống thuốc để ghi nhận số động vật chết, sống trong mỗi lụ và theo dừi thờm 2 tuần tiếp theo.
Chỉ tiêu đánh giá kết quả
Theo dừi sỏt sao 72 giờ sau khi uống thuốc. Theo dừi thờm 2 tuần tiếp theo. Ghi chép đầy đủ chi tiết mỗi diễn tiến trong thời gian đó.
Ghi giờ cho uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng bất thường, giờ chuột chết (nếu có) và tình trạng ngộ độc trước khi chuột thí nghiệm chết.
Ghi nhận số động vật chết trong từng lô, lập bảng phân suất tử vong.
Xét nghiệm đại thể ngay sau khi chết đối với chuột chết và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc thử nghiệm đối với động vật còn sống.
Công thức tính LD50
Xác định LD50 theo phương pháp Karber – Behrens [14]:
Dùng trực tiếp các trị số của liều, công thức như sau:
LD50 = LD100 -
Trong đó ntb là số trung bình các con vật của mỗi lô. Tất nhiên:
ntb =
K là số lô thí nghiệm
Nếu số con vật bằng số lô thì ntb = ni
2.2.4. Phương pháp đánh giá tác dụng kháng viêm khi phối hợp Meloxicam – PT5
2.2.4.1. Phương pháp gây viêm cấp thử nghiệm trên phù chân chuột gây bằng carrageenan (Winter và cộng sự, trích dẫn bởi Levy và cộng sự, 1968)[40]
Nguyên tắc: Sau khi tiêm carrageenan 1% vào bàn chân chuột, carrageenan sẽ kích hoạt phản ứng viêm, gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch. Kết quả của quá trình này là hiện tượng phù bàn chân chuột.
Phương pháp tiến hành: Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng máy đo thể tích chân chuột Ugo-Basile vào các thời điểm: Trước khi gây viêm (V0); sau khi gây viêm 3h (V03).
Sau khi có kết quả V03, tính phần trăm độ tăng thể tích chân chuột (loại những chuột có độ phù chân < 50% ra khỏi nghiên cứu) và phân lô sao cho tỷ lệ tăng thể tích chân chuột ở các lô tương đồng nhau. Cho chuột uống thuốc 0,1 mL/10g thể trọng chuột, theo 8 lô (n=8) liều như sau:
- Lô bình thường: Không gây phù, uống nước cất 0,1 mL/10g thể trọng.
- Lô bệnh lí: Uống nước cất
- Lô 1: Uống Meloxicam 4 mg/kg
- Lô 2: Uống Meloxicam 8 mg/kg [12],[44].
- Lô 3: Uống PT5 10,35 g/kg và Meloxicam 4 mg/kg
- Lô 4: Uống PT5 20,7 g/kg và Meloxicam 8 mg/kg
- Lô 5: Uống PT5 20,7 g/kg
- Lô 6: Uống PT5 10,35 g/kg.
Sau uống thuốc, ta tiếp tục đo thể tích chân chuột vào các thời điểm: Sau uống thuốc 1h (V1), 3h (V3), 5h (V5), 24h (V24).
Kết quả được tính theo công thức của Fontaine [40].
- Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:
100
%
0 0 ì
= −
∆ V
V V Vt
Trong đó: V0: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt: Thể tích chân chuột sau khi gây viêm
- Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%)
% 100
%
% % ì
∆
∆
−
= ∆
C t C
V V I V
Trong đó: ∆VC% : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô chứng (%)
∆Vt%: Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô thuốc (%)
2.2.4.2. Phương pháp gây viêm mạn [40]
Chuột nhắt trắng cả hai giống, trọng lượng 18 – 22 g, được chia ngẫu nhiên thành 7 lô (n=8). Gây viêm mạn tính bằng cách cấy viên cotton trọng lượng 10 mg đã tiệt trùng (sấy 1200C trong 2 giờ) vào da lưng của mỗi chuột. Sau khi cấy u hạt, chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử nghiệm với thể tích 0,1 mL/10g thể trọng trong 07 ngày theo liều như sau:
- Lô bệnh lí: Uống nước cất
- Lô 1: Uống Meloxicam 4 mg/kg
- Lô 2: Uống Meloxicam 8 mg/kg
- Lô 3: Uống PT5 10,35 g/kg và Meloxicam 4 mg/kg
- Lô 4: Uống PT5 20,7 g/kg và Meloxicam 8 mg/kg
- Lô 5: Uống PT5 20,7 g/kg
- Lô 6: Uống PT5 10,35 g/kg.
Ngày thứ 8 giết chuột bằng đá khói trong bình kín, cố định chuột trên bàn phẫu thuật, dùng dao mổ, kéo và nhíp để bóc tách u hạt, cân trọng lượng u hạt ngay sau khi bóc tách. Sau đó, sấy khô u hạt ở nhiệt độ 560C trong 3 giờ bằng tủ sấy quạt gió đối lưu.
Cân trọng lượng u hạt (đã được trừ trọng lượng viên cotton) sau khi đã sấy khô, tiến hành so sánh giữ các lô. Tác dụng chống viêm biểu hiện bằng tỷ lệ (%) giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô thuốc thử so với trọng lượng này ở lô chứng. Khả năng kháng viêm mạn thể hiện qua khả năng giảm trọng lượng u hạt, tính theo công thức:
Trong đó: : Trọng lượng u hạt trung bình của lô chứng : Trọng lượng u hạt trung bình của lô điều trị
2.2.5. Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau khi phối hợp PT5 và Meloxicam
Phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic (phương pháp Koster) [40],[50]
Nguyên tắc: Koster và cộng sự đã sử dụng tác nhân gây đau là Acid acetic 1%. Acid acetic kích thích giải phóng các chất trung gian như Bradykinin, prostaglandin và các cytokine IL, TNF … gây ra cơn đau do viêm. Nếu thuốc có tác dụng giảm viêm thì cơn đau sẽ giảm.
Phạm vi ứng dụng: Các thuốc giảm đau không gây ngủ.
Phương pháp tiến hành: Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô 8 con. Được uống nước cất hoặc thuốc với thể tích 0,1 mL/10g thể trọng liều như sau:
- Lô bệnh lí: Uống nước cất
- Lô 1: Uống Meloxicam 4 mg/kg
- Lô 2: Uống Meloxicam 8 mg/kg
- Lô 3: Uống PT5 10,35 g/kg và Meloxicam 4 mg/kg
- Lô 4: Uống PT5 20,7 g/kg và Meloxicam 8 mg/kg
- Lô 5: Uống PT5 20,7 g/kg
- Lô 6: Uống PT5 10,35 g/kg.
Sau khi uống thuốc 1 giờ đối với cao PT5 và 30 phút đối với Meloxicam, tiến hành tiêm vào ổ bụng chuột dung dịch acid acetic 1% 0,2 mL/con. Đếm số lần quặn đau của chuột trong từng 5 phút cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm acid acetic. So sánh, đánh giá số lần đau theo từng 5 phút và tổng số cơn đau trong 30 phút.