CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Các phương tiện dùng cho thử nghiệm
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Nghiên cứu các tài liệu liên quan đến điện phân, công nghệ hoạt hóa điện hóa, công nghệ vi sinh.
Nghiên cứu tài liệu liên quan đến tình hình nhiễm khuẩn trong thực phẩm và các hóa chất khử trùng trong thực phẩm.
2.2.2. Phương pháp thực hiện thử nghiệm trong phòng thí nghiệm
2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến chất lượng Anolit a. Chế độ điện áp
Căn cứ theo các thông số của nhà sản xuất đưa ra, chúng tôi thay đổi điện áp một chiều đặt vào anốt và catốt của môđun MB-11, từ 24 V đến 32 V, mỗi bước thay đổi 2 V. Ở mỗi chế độ hệ thí nghiệm được vận hành ổn định trong vòng 15-20 phút sau đó lấy mẫu Anolit và tiến hành phân tích ngay các thông số cần thiết.
Cách đo: Lấy 150 ml dung dịch Anolit cho vào cốc thủy tinh 200 ml, sau đó dùng máy đo chuyên dụng đo trực tiếp các thông số này.
Trong thí nghiệm này, lưu lượng nước chảy qua buồng catốt (QCa) và lưu lượng sản phẩm anolit (QA) được đặt ở chế độ tối đa (QCa=20 L/h; QA=120 L/h).
b. Chế độ bơm muối
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng lưu lượng muối đầu vào đến chất lượng anolit khi cố định các thông số: UDC = 29V, QA=120 L/h, QCa=20 L/h. Lượng muối bơm vào ở các thí nghiệm là: 75 g/h, 78, 96, 126, 159, 274, 432 g/h. Sau khi máy chạy
ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo các thông số lí- hóa của dung dịch anolit như phần trên.
c. Ảnh hưởng của lưu lượng anolit
Trong nghiên cứu này chúng tôi giữ nguyên lưu lượng của catolit là 20 L/h và thay đổi lưu lượng của Anolit trên cơ sở điều chỉnh lưu tốc kế 3 (trong sơ đồ hình 3.6) từ 75 đến 150 L/h. Điện áp đặt giữa hai đầu điện cực là 29V. Tiến hành đo các thông số lí-hóa của dung dịch anolit (như trình bày phần trên).
2.2.2.2. Xác định độ ổn định của dung dịch anolit theo thời gian.
Chất lượng của dung dịch anolit được kiểm soát qua các thông số lí – hóa cơ bản như: pH, thế ôxy hóa khử ORP, nồng độ clo hoạt tính, tổng chất rắn hòa tan TDS. Hệ thống vận hành liên tục từ 7 giờ sáng đến 16 giờ cùng ngày. Lấy mẫu phân tích Anolit được thực hiện 1 giờ, 2 giờ, 3, 4, 7 và 8 giờ sau khi chạy máy.
2.2.2.3. Xác định khả năng diệt khuẩn của anolit Bố trí thí nghiệm:
Chuẩn bị dung dịch anolit (dung dịch A) theo các thông số cơ bản sau: pH = 6,5; Thế ôxy hóa khử (ORP) = 800 mV; Nồng độ chất ôxy hóa (tính theo clo hoạt tính) lần lượt là 0; 0,1; 0,25; 0,5; 1 mg/l.
Chuẩn bị dịch hỗn hợp E.coli mật độ 104 CFU/ml và Coliforms mật độ 105 CFU/ml (dịch B).
a. Ảnh hưởng của nồng độ đến hiệu lực khử trùng
- Hút 9ml Anolit ở các nồng độ vào các ống nghiệm không đã vô trùng.
- Bổ sung 1ml dịch gốc, lắc đều, rồi để trong thời gian 5 phút.
- Bổ sung 0,2 ml Na2S2O3 0,1N, lắc đều trong 30 giây để khử Clo dư.
- Xác định mật độ E.coli và Coliforms còn lại trong dung dịch.
b. Ảnh hưởng của thời gian diệt khuẩn đến hiệu lực khử trùng
- Cho 9 ml dung dịch A nồng độ 0,5 mg/l tiếp xúc với 1 ml dịch B với thời gian tiếp xúc lần lượt là 10 giây; 30 giây; 1 phút; 5 phút.
- Sau đó khử Clo dư bằng Na2S2O3 0,1 N rồi xác định mật độ E.coli và Coliforms còn lại trong dung dịch.
Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 10 lần (kí hiệu là mẫu 1, mẫu 2, …, mẫu 10) 2.2.3. Phương pháp thực hiện các thử nghiệm tại hiện trường
Các thử nghiệm được thực hiện ngay tại nơi đang sản xuất của nhà máy. Các qui trình thực hiện thử nghiệm đều được thực hiện theo qui trình thông thường của nhà máy.
2.2.3.1. Khảo sát thực trạng nhiễm khuẩn môi trường trong cơ sở chế biến thủy sản Sau ca sản xuất, lấy ngẫu nhiên 3 găng tay cao su, 3 rổ nhựa, 3 thớt nhựa, 3 chậu nhựa, 1 bàn inox và chọn 3 viên gạch ceramic có vị trí cách xa nhau. Các dụng cụ và bề mặt môi trường trên đã được vệ sinh qua bằng nước rửa bát cho sạch các chất hữu cơ. Tiến hành lấy mẫu bề mặt bằng tăm bông trên diện tích 50 cm2 (riêng găng tay cao su lấy mẫu trên diện tích 25 cm2). Bàn inox lấy ở 3 vị trí: đầu bàn, giữa bàn và cuối bàn.
2.2.3.2. Ngâm khử trùng các dụng cụ nhỏ
Phân tích vi sinh mỗi dụng cụ 80 mẫu bao gồm các chỉ tiêu vi khuẩn: tổng VKHK, Coliforms, E.coli và Staphylococcus trên các đối tượng là các dụng cụ nhựa (rổ, thớt, chậu) và găng tay cao su.
Các mẫu gồm có: 20 mẫu trước khử trùng, 20 mẫu sau khử trùng bề mặt dụng cụ được vệ sinh khử trùng theo phương pháp khử trùng thường qui (sử dụng canxi hypoclorit); 20 mẫu trước khử trùng, 20 mẫu sau khử trùng bề mặt dụng cụ được vệ sinh khử trùng theo phương pháp mới sử dụng anolit (và được chia đều thành 2 đợt thí nghiệm).
a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trước khử trùng: Sau ca sản xuất, chọn 10 dụng cụ đã qua sử dụng và đánh số từ 1 đến 10. Làm sạch chất thải rắn, sau đó tráng lại bằng nước sạch, rồi tiến hành lấy mẫu bề mặt trên diện tích 50 cm2 (đối với các dụng cụ nhựa) hoặc 25 cm2 (đối với găng tay cao su). Dùng tăm bông đã tiệt trùng quệt đều trên diện tích lấy mẫu và đưa vào ống nghiệm đựng 10 ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng. Đặt ống nghiệm vào thùng lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để bảo quản và phân tích trong ngày.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trước khử trùng, các dụng cụ nhỏ sẽ được ngâm vào thùng chứa dung dịch canxi hypoclorit nồng độ 100 mg/l (clo hoạt tính) trong thời gian 5 phút. Sau đó tráng rửa dưới vòi nước chảy mạnh trong thời gian 1 phút rồi tiến hành lấy mẫu sau khử trùng như đã trình bày ở trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng bằng dung dịch siêu ôxy hóa (anolit)
Lấy mẫu trước khử trùng: qui trình khử trùng tương tự như vệ sinh khử trùng thường qui.
Lấy mẫu sau khử trùng: Các dụng cụ nhỏ được chà rửa bằng bàn chải nhựa trong dung dịch Anolit (100 mg/l clo hoạt tính) có thêm chất tẩy rửa (nước rửa bát (1%)) trong thời gian 1 phút. Sau đó ngâm các rổ nhựa vào dung dịch anolit (100 mg/l) trong thời gian 5 phút. Sau khi tráng rửa dưới vòi nước chảy mạnh, tiến hành lấy mẫu sau khử trùng tương tự như đã trình bày ở phần trên.
Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 2 lần vào các thời điểm khác nhau.
2.2.3.3. Khử trùng bề mặt lớn
2.2.3.3.1. Khử trùng và lấy mẫu trên bề mặt thép inox a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trước khử trùng: Chuẩn bị 5 bàn inox sau ca sản xuất. Trước tiên mặt bàn được thu dọn hết các sản phẩm thừa, sau đó được cọ rửa bằng nước xà phòng, dội sạch bằng nước. Lấy mẫu bề mặt tại 2 vị trí (một ở đầu bàn, một ở giữa bàn) với diện tích lấy mẫu là 50 cm2 bằng tăm bông vô trùng.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trước khử trùng, mặt bàn được lau bằng nước pha canxi hypoclorit có nồng độ clo hoạt tính 100 mg/l. Sau đó, tráng rửa bằng nước sạch và lấy mẫu sau khử trùng bề mặt theo cách tương tự như đã trình bày ở phần trên với diện tích lấy mẫu 50 cm2.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng sử dụng dung dịch anolit
Lấy mẫu trước khử trùng: Qui trình tương tự như trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: Tiến hành tương tự như với khử trùng thường qui (thay canxi hypoclorit bằng Anolit có nồng độ clo hoạt tính 100 mg/l).
2.2.2.3.2. Khử trùng và lấy mẫu trên bề mặt gạch ceramic a. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng thường qui
Lấy mẫu trước khử trùng: Chọn 10 viên gạch ceramic, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Lấy mẫu bề mặt trên từng viên gạch làm mẫu trước khử trùng với diện tích lấy mẫu là 50 cm2.
Lấy mẫu sau khử trùng: Sau khi lấy mẫu trước khử trùng, các viên gạch được chà rửa bằng xà phòng, khử trùng bằng nước pha canxi hypoclorit có nồng độ clo hoạt tính 100 mg/l. Sau đó, dội lại bằng nước sạch và lấy mẫu sau khử trùng bề mặt theo cách tương tự như đã trình bày ở phần trên.
b. Lấy mẫu vi sinh kiểm tra vệ sinh khử trùng sử dụng dung dịch anolit
Lấy mẫu trước khử trùng: Qui trình tương tự như trình bày ở mục a.
Lấy mẫu sau khử trùng: Phương pháp khử trùng tiến hành tương tự như khử trùng thường qui (thay canxi hypoclorit bằng dung dịch anolit có nồng độ clo hoạt tính là 100 mg/l). Lấy mẫu sau khử trùng trên diện tích 50 cm2.
2.2.4. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm vi sinh
- Phương pháp lấy mẫu vi sinh tại Xí nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu 1 (F34) – Công ty BASEAFOOD, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu được thực hiện theo hướng dẫn lấy mẫu vệ sinh công nghiệp trong “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản”. SEAQIP, Nhà xuất bản Nông nghiệp 2004.
- Các mẫu vi sinh khử trùng bề mặt dụng cụ và môi trường trong chế biến thực phẩm được lấy theo phương pháp dùng tăm bông trên bề mặt xác định.
Các bước lấy mẫu:
+ Dùng cồn khử trùng tay
+ Đặt khuôn lấy mẫu đã khử trùng lên bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm (khuôn lấy mẫu là bản kim loại khoét lỗ ở giữa với diện tích là 25cm2, hoặc 50cm2 tùy theo bề mặt cần lấy mẫu là lớn hay nhỏ).
+ Dùng tăm bông vô trùng quét đều mặt diện tích trong của khuôn.
+ Sau khi quét xong, thao tác gần ngọn lửa đèn cồn, mở nắp ống nghiệm và nhanh chóng cho tăm bông vào. Nút ống nghiệm lại (chú ý không để tăm bông chạm vào miệng ống nghiệm.
+ Cho ống nghiệm chứa tăm bông đã lấy mẫu vào một túi PE vô trùng. Ghi các thông tin về vị trí lấy mẫu vào thẻ nhận diện. Cho thẻ vào túi chung với ống mẫu. Cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bằng ghim bấm.
+ Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt. Cho đá khô phủ quanh túi mẫu.
- Việc lấy mẫu xét nghiệm vi sinh được thực hiện của hai bên thử nghiệm:
cán bộ kỹ thuật của Xí nghiệp và người thực hiện đề tài.
2.2.5. Phương pháp phân tích vi sinh
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu bằng phương pháp đĩa thạch:
+ Sử dụng môi trường PCA (Merck) để định lượng khuẩn lạc tổng vi khuẩn hiếu khí.
+ Sử dụng môi trường Chromocult (Merck) để định lượng khuẩn lạc Coliforms và E.coli.
+ Sử dụng môi trường Violet Red Bile (VRB) (Merck) để định lượng khuẩn lạc Coliforms.
+ Sử dụng môi trường Eosin Methylene Blue (EMB) (Merck) để định lượng khuẩn lạc E.coli.
+ Sử dụng môi trường Baird-parker agar (Merck) để định lượng khuẩn lạc Staphylococus.
+ Sử dụng môi trường SS agar để định lượng khuẩn lạc Salmonella.
Phân tích các mẫu bề mặt: Coliforms theo NM 44-2001, E.coli theo NMKL 125-1996, Staphylococcus theo NMKL 66-1999, Salmonella theo NMKL-71-1999 và tổng vi khuẩn hiếu khí theo NM 86-1999.
2.2.6. Xử lý số liệu
Cách tính kết quả: Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau :
Trong đó :
A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn Ni :số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa Fi : độ pha loãng tương ứng
Trong thí nghiệm thực nghiệm, các mẫu vi sinh được lấy bằng phương pháp tăm bông trên bề mặt xác định nên mật độ vi khuẩn được tính bằng công thức:
A’ (CFU/cm2) = Trong đó:
A’: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1cm2 mẫu V’: thể tích dịch pha loãng ban đầu
S : diện tích bề mặt lấy mẫu
Các kết quả phân tích vi sinh được xử lý theo phương pháp so sánh trung bình tổng thể bằng phần mềm EXCEL: AVERAGE, STDEV, LG