Cây phát sinh loài dựa trên gen 12S mtDNA
Sau khi so sánh và gióng trình tự, 557 bp (base pair) đoạn gen 12S mtDNA
của 45 loài ốc cối được sử dụng cho việc phân tích mối quan hệ tiến hóa. Trình tự
của hai loài ốc thuộc họ Conoidae Lophiotoma cerithiformis và Thatcheria
mirabilis từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại. Các thông số trình tự gen 12S
Phân tích cây phát sinh chủng loại được tiến hành dựa trên 2 thuật toán
Maximum parsimony (MP), và Bayesian inference (BI). Kết quả phân tích dữ liệu
trình tự gen 12S mtDNA dựa trên phương pháp MP và BI cho kết quả tương tự về
cây đa dạng loài.
Cây phân loài thu được theo phương pháp MP được trình bày trên hình 3.5
với giá trị bootstrap (BT) và độ tin cậy (PP) được biểu hiện trên các nhánh.
Từ cây phát sinh loài (hình 3.5) cho thấy các loài ốc cối sắp xếp thành 6
nhóm loài (nhóm I – VI) với giá trị BT và độ tin cậy tương đối (>70%). Nhóm I lại
tiếp tục được chia thành 4 nhóm nhỏ. Nhóm I bao gồm: NhómI.1: Conus
tessulatus, C. ebruneus, C. betulinus, C. carracteriscus, C. arenatus; Nhóm I.2: C.
radiates, C. parius, C. flavus, C. laterculatus; Nhóm I.3: C.ebraeus, C. judaceus;
Nhóm I.4: C. sulcatus, C. virgo; Nhóm II: C. aulicus, C. episcopatus, C. crocatus, C. omaria, C. textile, C. furvus, C. ammira, C.bandanus, C. marmoreus, C.
gloriamaris, C. immelmani; Nhóm III: C. capitaneus, C. vexilum, C. miles, C.
striatus; Nhóm IV: C. tulipa, C. geographus; Nhóm V: C. circumsicus, C.
aurisiatus, C. stercusmuscarum; Nhóm VI: C. imperalis, C. distans, C. imperalisgb, C. brunneus; và một số loài có vị trí không xác định như: C. quercinus, C. catus, C. striolatus, C. magus, C. consor, C. achatinus, C. bullatus, C. litteratus.
Cây phát sinh loài từ phương pháp BI cho kết quả gần giống về các nhóm
loài hình 3.5 nhưng khác nhau ở vị trí sắp xếp và sự khác biệt ở vị trí của một số loài. Các nhóm I.2 (ăn giun biển), I.3 (ăn giun biển) và IV (ăn cá) giống nhau về
thành phần loài trong các nhóm. Nhóm V (nhóm ăn nhuyễn thể) cơ bản là giống
nhau chỉ khác là C. bandanus và C. marmoreus được thay bằng Conus litteratus.
Nhóm V (ăn cá) có thêm C. bullatus. Nhóm III thiếu Conus striatus.
Trong phân tích gen 12S, hầu hết các loài trong các nhóm đều có chế độ ăn
trương đối rõ nét. Nhóm ăn nhuyễn thể (nhóm II) được phân tách rất rõ ràng, các
loài ăn giun biển thuộc các nhóm I, III, VI; các loài ăn cá thuộc các nhóm IV, V.
xác định trên cây phân loài nhưng chúng cũng được nhóm gần nhau và có cùng chế độ dinh dưỡng là ăn cá.
Cây phát sinh loài dựa trên gen Calmodulin.
Sau khi so sánh và gióng trình tự, 296 bp được sử dụng cho việc phân tích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mối quan hệ tiến hóa. Các thông số trình tự gen Calmodulin được trình bày ở bảng
2.2.
Kết quả phân tích đối với trình tự gen Calmodulin dựa trên 2 phương pháp
MP và BI cho kết quả tương tự về cây đa dạng loài. Kết quả được trình bày ở hình
3.6 với cây đa dạng loài thu được từ phân tích MP với giá trị BT và giá trị tin cậy
(PP) của thuật toán BI được biểu hiện trên các nhánh.
Cây phát sinh loài cho thấy các loài ốc cối sắp xếp thành 8 nhóm loài (nhóm
I – VIII) với giá trị BT và độ tin cậy tương đốicao (> 70%). Nhóm I gồm những
loài Conus tessulatus, C. ebruneus, C. tulipa, C. geographus. Nhóm II gồmC.
betulinus, C. carracteriscus. Nhóm III gồm C. consor, C. magus, C.
stercusmuscarum, C. striatus. Nhóm IV gồm C. aureus, C. textile, C. legatus, C.
omaria, C.bandanus, C.ebraeus, C. miliaris, C. sponsalis. Nhóm V gồm C. capitaneus, C. mustelinus, C. miles, C. vexilum, C. generalis, C. distan, C. varius.
Nhóm VI gồm C. lividus, C. quercinus, C. leopadus. Nhóm VII gồm C. furvus, C.
litteratus. Nhóm VIII gồm flavidus, C. virgo. Và hai loài có vị trí phân loại không xác định là Conus imperalis, Conus terebra.
Cây phân loài xây dựng từ gen Calmodulin cũng cho thấy mối quan hệ khá
rõ nét về chế độ dinh dưỡng của các loài ốc cối. Các loài có cùng chế độ dinh
dưỡng được nhóm chung với nhau. Nhóm I, III hầu hết là các loài ăn cá; nhóm II,
V, VI, VIII là nhóm các loài ăn giun biển; nhóm IV là các loài ăn nhuyễn thể.
Từ hai cây phát sinh loài dựa trên gen 12S và calmodilin (hình 3.5 và hình
3.6) cho thấy các nhóm loài được phân tách tương đối rõ ràng về chế độ dinh
dưỡng, hơn nữa, nhiều nhóm còn giống nhau về thành phần loài. Cụ thể, một số loài
giống với nhóm V (V) của hình 3.6. Những điều trên được thể hiện rõ hơn trong bảng 3.3.
Ở cả hai cây phát sinh loài, các loài C. tessulatus/C. ebruneus, C.
betulinus/C. carracteriscus, C. tulipa/C. geographus luôn thể hiện mối quan hệ gần gũi, điều này cũng phù hợp với các phân tích trước đây sử dụng chỉ thị Calmodulin,
12S, CO1 của Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005; Nam và cs, 2009, Đặng
Thúy Bình, 2011.
Bảng 3.3: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại 12S mtDNA và Calmodulin từ 2 phương pháp MP và BI. Các loài giống nhau trong hai cây phát sinh loài được in đậm. KXĐ: những loài ở vị trí không xác định. Nhóm
được phân loại dựa theo chế độ ăn (V: ăn giun biển, M: ăn nhuyễn thể, P: ăn cá, U: chưa biết ). Nhóm loài 12S mtDNA Chế độ dinh dưỡng Nhóm
loài Calmodulin nDNA
Chế độ dinh dưỡng I.1 (V) Conus tessulatus P+V I (P) Conus tessulatus P+V (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Conus ebruneus P+V Conus eburneus P+V
Conus betulinus V Conus geographus P
Conus
carracteriscus V Conus tulipa P+M
Conus arenatus V II (P) Conus betulinus V
IV(P) Conus tulipa P+M Conus caracteristicus V
Conus geographus P
II (M) Conus aulicus M IV (M) Conus aureus U
Conus crocatus M Conus legatus M
Conus omaria M Conus omaria M
Conus bandanus M Conus bandanus M
Conus furvus M Conus ebraeus V
Conus ammira M Conus miliaris M
Conus episcopatus M Conus sponsalis M
Conus marmoreus M VII
(M,V) Conus furvus M
Conus gloriamaris M Conus litteratus V
Conus immelmani M V (V) Conus mustelinus V
III (V) Conus capitaneus V+P Conus capitaneus P+V
Conus vexilum V Conus vexilum V
Conus miles V Conus mile V
Conus striatus V+P Conus generalis V
VI (V) Conus imperalis V Conus distan V
Conus distans V Conus varius V
Conus imperalis V KXĐ Conus imperialis V
Conus brunneus U Conus terebra M
I.4 (V,U)
Conus sulcatus U VIII (V) Conus flavidus V
Conus virgo V Conus virgo V
V (P) Conus circumsicus U VI (V) Conus lividus V (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Conus aurisiatus P Conus leopardus V
stercusmuscarum
KXĐ Conus quercinus V III (P) Conus
stercucmuscarum
P
Conus catus P Conus magus P+M
Conus striolatus U Conus consor P
Conus magus P+M Conus striatus P+V
Conus consor P
Conus litteratus V
Conus achatinus P
Hình 3.5: Cây phát sinh loài dựa trên gen 12S mtDNA của ốc cối thu tại vùngbiển Nam Trung Bộ, Việt Nam. Các loài ốcLophiotoma cerithiformis và
Thatcheria mirabilis được sử dụng làm nhóm ngoại. Giá trị Bootstrap (phân tích MP) và giá trị tin cậy được biểu hiện tại các nhánh. Các nhóm loài hình thành từ cây phát sinh loài được kí hiệu theo thứ tự.
Hình 3.6: Cây phát sinh loài dựa trên gen calmodulin của ốc cối thu tại vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam. Loài Conus sp. Panama được sử dụng làm nhóm ngoại. Giá trị Bootstrap (phân tích MP) và giá trị tin cậy được biểu hiện tại các nhánh. Các nhóm loài hình thành từ cây phát sinh loài được kí hiệu theo thứ tự.
3.2. Thảo luận
3.2.1. Sự khác biệt về trình tự gen của các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại
Phân tích trên gen 12S
Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loài từ phương pháp MP và BI và chế độ
dinh dưỡng đi kèm được trình bày ở bảng 3.1.
Các loài ốc cối được sắp xếp trong cùng một nhóm trên cây tiến hóa thể hiện
mức độ khác biệt di truyền thấp. Ở nhóm ăn giun biển(V) I.1 tỷ lệ khác biệt giữa
các trình tự nằm trong khoảng 1,1% - 15,4%, khác biệt ít nhất là C. tessulatus – C.
eburneus 1,1%, nhiều nhất là C. betulinus – C. carracteriscus 15,4%. Ở nhóm II (M) tỷ lệ khác biệt của các trình tự vào khoảng 4,9% - 10,4% (C. aulicus/C. episcopatus - C. aulicus/C. marmoreus). Ở nhóm ăn cá (nhóm IV và nhóm V) tỷ lệ
khác biệt khoảng 0,9% - 7,3% (C. aurisiacus/C. circumcisus – C. tulipa/C.
geographus).
Các loài ốc cối được sắp xếp khác nhóm trên cây tiến hóa thể hiện mức độ
khác biệt di truyền cao hơn các loài cùng nhóm. Sự khác biệt trình tự giữa hai loài
C. geographus (ăn cá) và C. distans (ăn giun) là 23,1%; giữa C. vexilum (ăn giun) và C. furvus (ăn nhuyễn thể) là 35%.
Dựa vào các thông số trên ta thấy sự khác biệt di truyền giữa các loài có
cùng chế độ dinh dưỡng thấp hơn các loài khác chế độ dinh dưỡng và từ đó có thể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thấy dựa vào sự khác biệt di truyền giữa các trình tự các loài được xếp gần nhau
hoặc cách xa nhau trên cây tiến hóa.
Phân tích trên gen Calmodulin
Nhìn chung, các loài ốc cối trong phân tích gen Calmodulin có tỉ lệ khác biệt
tương đối thấp. Tỉ lệ khác biệt giữa Conus mustelinus (V) - Conus capitaneus
(P+V) chỉ có 0,8%, giữa Conus textile (M) - Conus aureus (M) chỉ 2,3%. Các loài
trong nhóm ăn cá (nhóm I) thể hiện mức độ khác biệt nằm trong khoảng 7,4% (Conus tessulatus/C. ebruneus ) – 8,5% (C. ebruneus/C. tulipa). Trong nhóm ăn
giun biển, tỉ lệ khác biệt di truyền khoảng 6,9% - 12,5%. Duy chỉ có loài C. miliaris
24,1% (C. miliaris (M)/C. ebraus (V)) - 35,1% (C. miliaris (M)/C. lividus (V)). Điều đó cũng thể hiện các loài có chế độ dinh dưỡng khác nhau thì tỉ lệ khác biệt di truyền cao hơn các loài có cùng chế độ dinh dưỡng.
So sánh sự khác biệt di truyền của các loài trong phân tích 12S và
calmodulin (bảng 3.1 và bảng 3.2) ta thấy, nhiều loài trong phân tích Calmodulin có
tỉ lệ khác biệt di truyền thấp hơn các loài trong phân tích 12S. Ví dụ, sự khác biệt di
truyền của hai loài C. betulinus – C. carracteriscus là 7,4%, sự khác biệt di truyền
của hai loài C. tulipa - C. geographus là 2,7%. Trong khi đó, tỉ lệ khác biệt của C.
betulinus – C. carracteriscus; C. tulipa - C. geographus trong phân tích 12S lần lượt là 15,4% và 7,3%. Điều này cho thấy gen 12S thể hiện mức độ tiến hóa cao hơn gen calmodulin.
3.2.2. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử 12S mtDNA và Calmodulin
Chọn lọc tự nhiên xảy ra khi sự tuyệt chủng và đa dạng hóa của một loài bị
ảnh hưởng bởi sự khác biệt về mặt di truyền của những tính trạng ở mức độ loài. Cụ
thể, vùng phân bố địa lí và tiềm năng di chuyển gen giữa các quần thể bị ảnh hưởng
bởi khả năng phân tán của loài. Các loài sinh vật biển hạn chế về khả năng phát tán loài thường có vùng phân bố hẹp, và cấu trúc quần thể không đồng nhất so với các
loài có mức độ phát tán cao. Thông thường, thay đổi đột ngột ở mức độ địa phương
có nhiều khả năng loại bỏ một loài với vùng phân bố giới hạn. Các loài có ấu trùng
không phát tán thường đối mặt với sự tuyệt chủng nhiều hơn so với các loài có giai
đoạn ấu trùng trôi nổi (Duda và Palumbi, 1999).
Phân loại ốc cối thông thường chỉ dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn và
màu sắc hay trên vân vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ (Kohn và
cs, 1999). Bên cạnh đó một chỉ tiêu quan trọng là mô tả các dải răng kitin của các
loài ốc (Frankin và cs, 2007, Duda và cs, 2009). Tuy nhiên, việc định danh loài ốc
cối bằng mẫu sống thường gặp nhiều khó khăn do sự biến dị liên quan đến điều kiện tự nhiên của khu vực phân bố, hoặc biến dị cá thể. Hơn nữa, lớp nhầy bọc ngoài vỏ ốc (periostracum) thường đục và bao phủ toàn bộ vỏ khiến các vân màu sắc và
đường gờ trên vỏ bị che khuất. Việc loại bỏ lớp bao này bằng KOH (hoặc NaOH) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
có thểảnh hưởng đến các vân màu và không thể áp dụng đối với mẫu vật sống. Mẫu
vật cũng thường xuyên thiếu vỏ của ấu trùng và các vân màu có thể nhạt đi hoặc mất hẳn. Đặc điểm hình thái có thể chịu tác động của môi trường, biến dị cá thể
cùng loài (intraspecific) và khác loài (interspecific), dễ gây nhầm lẫn trong quá trình
phân loại. Không chỉ có các thành phần độc tố là đặc trưng cho loài, các biến dị liên
quan đến vùng địa lí và năm sinh sống cũng đã được ghi nhận (e.g. Bingham và cs, 1996). Chính vì vậy, hệ thống phân loại của ốc cối hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi (Duda và cs, 2009).
Hiện nay các chỉ thị phân tử được sử dụng rộng rãi và ngày càng đóng một
vai trò quan trọng trong nghiên cứu định danh loài, mối quan hệ tiến hóa cũng như
di truyền quần thể (Blaxter 2003, 2004; Hebert et al. 2003a,b; Stoeckle, 2003). Chỉ
thị phân tử được sử dụng chủ yếu là các gen của hệ gen DNA ti thể (COI và 16S
mtDNA (Duda và Rolan, 2005; Duda và Kohn, 2005; Nam và cs, 2009); 12S, tRNA-Val, cytochrome b (cytb) (Cunha và cs, 2008); vùng liên gen coxI/coxII
(Bandyopadhyay và cs, 2008), và hệ gen nhân (Duda và Palumbi, 2004); ITS2
(Nam và cs, 2009); megalin - like gene (Cunha và cs, 2008), calmodulin (Duda và
Kohn, 2005), hoặc kết hợp giữa các chỉ thị trên (Duda và Palumbi, 2004; Cunha và
cs, 2008; Nam và cs, 2009).
Hơn nữa, các nghiên cứu trong thời gian gần đây tập trung giải quyết các
hình thức tiến hóa (Duda và Palumbi, 1999, 2004), nguồn gốc phát sinh và mối
quan hệ tiến hóa loài (Duda và Rolan, 2005), sự phân hóa của ốc cối theo vùng địa
lí (Duda và Kohn, 2005; Cunha và cs, 2008) và theo hình thái vỏ lấy mô hình là
quần đảo phân tách Cape Verde ở trung tâm Đại Tây Dương (Cunha và cs, 2005).
Các phân tích cho thấy tất cả các loài ốc cối hình thành một nhánh tách biệt phân
hóa từ nhóm toxoglossate trong dưới loài Conacea (bao gồm 3 lớp của Tumidae và
Terebridae). Điều này cung cấp dữ liệu cho thấy ốc cối là một giống đồng dạng (Cunha và cs, 2005).
Theo Duda và Kohn (2005) các loài ốc cối (138 loài) ở vùng biển Ấn Độ -
Thái Bình Dương (IP), Đông Thái Bình Dương (EP) và Tây Đại Tây Dương (WA)
là con cháu từ hai nhánh chính và phân hóa ít nhât cách đây 33 triệu năm. Dựa trên
sự phân bố địa lí, một nhóm bắt nguồn từ vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương
(nhóm lớn) và nhóm kia thuộc khu vực Đông Thái Bình Dương và Tây Đại Tây
Dương (nhóm nhỏ). Các nhánh chính thức khác nhau đáng kể về kích thước và
thành phần loài từ các khu vực địa lí khác nhau.
Trong nghiên cứu hiện tại, chỉ thị 12S mtDNA đã phân chia các loài ốc cối (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thành các nhóm riêng biệt (6 nhóm, hình 3.6). Một số nhóm loài phù hợp với các
nghiên cứu trước đó, ví dụ các loài ốc ăn nhuyễn thể C. bandanus/C. marmoreus;
C. textile/C. ammiralis/C. gloriamaris (thuộc nhóm Cylinder (Montfort, 1810)); C. aulicus/C. crocatus/C. episcopatus/C. omaria và C. furvus (thuộc nhóm Darioconus (Iredale, 1930) được phân chia về cùng một nhánh (Espiritu và cs, 2001; Duda và
Kohn, 2005; Nam và cs, 2009). Các loài ốc ăn cá được nhóm chung với nhau (nhóm
IV và nhóm V, hình 3.6). Hai loài C. miles/C. quercinus (V) luôn thể hiện mối quan
hệ gần gũi (Espiritu và cs,2001; Duda và Kohn, 2005). Tuy nhiên, hai loài trên lại
được sắp xếp chung vào cùng một nhánh với các loài vừa ăn cá vừa ăn giun biển (C.
capitaneus, C. striatus). Trong nhóm I.1 (Conus tessulatus, C. betulinus, C. carracteriscus, C. arenatus) là các loài ăn giun biển, chỉ có C. ebuneus là ốc ăn cá,
có thể cho thấy hai phương thức dinh dưỡng này có quan hệ tiến hóa. Theo Duda và
Kohn (2005) chế độ ăn cá của ốc cối có thể có nguồn gốc từ các loài ăn giun biển
(các loài ăn giun biển thường nằm ở gốc cây tiến hóa và được xem là phương thức tổ tiên) hoặc có thể là phương thức dinh dưỡng hỗn hợp. Loài C. californicus có phương thức dinh dưỡng đa dạng, có thể ăn cá, nhuyễn thể, giun biển và thậm chí
cả giáp xác (Stewward and Gilly, 2005). Ốc cối được biết đến như một giống có
phương thức dinh dưỡng riêng biệt liên quan chặt chẽ đến sự hình thành độc tố và
sự tiến hóa, phân tích dựa trên chỉ thị 12S mtDNA thể hiện tương đối rõ mối quan
hệ tiến hóa của ốc cối cũng như mối liên hệ phát sinh loài và phương thức dinh dưỡng.
So sánh với cây phát sinh loài dựa trên gen 12S mtDNA của Nam và cs
(2009), phân tích đã không thể làm sáng tỏ mối quan hệ giữa các loài ăn nhuyễn thể
mới tách ra gần đây. Nhưng cây phát sinh loài từ gen 12S trong nghiên cứu hiện tại,
nhóm ăn nhuyễn thể (nhóm II, hình 3.5) được phân tách rất rõ ràng. Tuy nhiên,
trong hai cây phát sinh loài trên có sự tương đồng về thành phần loài ở các nhóm ăn
cá và ăn giun biển. Ví dụ như trong phân tích của Nam và cs (2009) nhóm ăn cá (P) (C. aurisiacus, C. stercusmuscarum) và nhóm ăn giun biển (V) (C. parius, C.