CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Thiết kế nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, can thiệp ngẫu nhiên, có đối chứng, mô tả cắt ngang và theo dừi dọc. Trong nghiờn cứu này, chuột gõy bộo phỡ bằng thức ăn giàu chất béo trong 7 tuần nuôi. Sau đó được cho uống thuốc hoặc nước muối sinh lý với cùng thể tích bằng kim uống thuốc chuyên dụng, liên tục trong 12 tuần, theo phương pháp của Wu và Parhofer (2014) [164].
2.2.2. Phương tiện, dụng cụ và hóa chất
Nguyên liệu làm thức ăn cho chuột do công ty Nutricare cung cấp (Nutricare, Hà Đông, Hà Nội). Thành phần của thức ăn theo hai chế độ được trình bày trên Bảng 2.1 và thức ăn được làm thành dạng viên.
Bảng 2.1. Thành phần các chất trong thức ăn cho chuột (g/kg) hai chế độ ăn.
Thành phần Chế độ ăn thường Chế độ ăn giàu chất béo
Tinh bột ngô 450,41 270.41
Bột dầu thực vật 230,0 230,0
Casein 200,0 200,0
Cellulose 50,0 50,0
CaCO3 30,5 30,5
Mỡ lợn 30,0 200,0
Chất khoáng tổng hợp 5,0 5,0
Vitamin tổng hợp 1,67 1,67
Cholesterol - 10,0
Choline bitartrate 2,4 2,4
Tert Butylhydroquinone 0,02 0,02
Tổng (g) 1.000 1.000
Kcal 4.159,9 4.859,9
% Fat (calories) 15,1 38,9
* Nguồn: theo Seo và cs. (2012) [121]
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm nước muối NaCl đẳng trương (natri clorid 0,9%) (công ty Fresenius Kabi, Quy Nhơn, Bình Định), thuốc lovastatin dạng bột (Sigma Aldrich) (Hình 2.1) .
Hình 2.1. Lọ thành phẩm lovastatin (A) và natri clorid 0,9% (B).
Chế phẩm nano Alginate/Chitosan/Lovastatin với tỷ lệ 8:2:10%.
Lovastatin, dạng bột, bảo quản ở 0–4o C (Viện Kỹ thuật nhiệt đới, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam).
Các dụng cụ, thiết bị và vật liệu sử dụng trong nghiên cứu để đo sinh trắc của động vật tại Bộ môn Sinh lý học, HVQY, gồm cân điện tử Shimadzu BL- 620S (Shimadzu Corp., Nhật Bản) 1/10 mg để xác định trọng lượng chuột;
cân điện tử độ chính xác tới 1/10.000 để xác định trọng lượng của cơ quan nội tạng và cân hóa chất có độ chính xác tương tự, thước đo để xác định chiều dài, vòng ngực và vòng bụng của chuột (độ chính xác đến milimét).
Xét nghiệm thành phần chất trong máu thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, HVQY, sử dụng máy ly tâm Hettich Universal 320 (Hettich, Đức), máy xét nghiệm sinh hóa tự động Erba XL -180 và các kit cho xét nghiệm glucose, cholesterol và triglycerid (Erba, Đức).
Dùng kim tiêm chuyên dụng cho chuột uống thuốc. Các nghiên cứu về hành vi được thực hiện trong các buồng thực nghiệm cùng các dụng cụ
A A B
chuyên dụng (môi trường mở, buồng đánh giá nhận thức đồ vật, mê lộ nước) [14], [22], [26], [53], [115], [116].
Các phòng thực nghiệm yên tĩnh, nhiệt độ ổn định ở 25 ± 1o C, có đặt các dụng cụ thiết bị nghiên cứu hành vi, gồm môi trường mở, buồng đánh giá nhận thức đồ vật và mê lộ nước, cùng hệ thống ghi và phân tích hành vi.
Môi trường mở: là một dụng cụ hình trụ tròn (đường kính 80 cm, cao 25 cm) bằng nhựa composit đen, được chia theo thiết kế chương trình về hành vi thành vùng trung tâm (ở chính giữa, đường kính 25 cm) và vùng ngoại vi (Hình 2.2A).
Mê lộ nước: là một dụng cụ inox hình trụ tròn, sơn đen (đường kính 100 cm, cao 30 cm), chia 4 góc phần tư. Bến đỗ (platform) đường kính 9 cm làm bằng mica không màu được đặt cố định ở một góc phần tư. Khi thực nghiệm, cho nước ngập 20 cm, mặt bến đỗ chìm dưới mặt nước 0,5-1 cm (Hình 2.2B).
Hình 2.2. Môi trường mở (A) và mê lộ nước (B) có chuột ở trong.
1: vùng trung tâm, 2: vùng ngoại vi của môi trường mở. P: bến đỗ (platform) trong mê lộ nước.
Môi trường đánh giá nhận thức đồ vật: sử dụng môi trường mở. Đồ vật được thiết kế gồm hai vật thể giống nhau bằng nhựa ABS trắng, hình nón và một vật thể giống hình người tuyết gồm hai phần hình khối cầu gắn chồng lên nhau, có cùng chiều cao (cao 15,5 cm, đường kính chân đế 7,5 cm).
1
2
A
P B
Hệ thống ghi và phân tích hành vi: sử dụng camera C525HD (Logitech, Hoa Kỳ) kết nối với máy tính có phần mềm Any-Maze (Stoelting, Hoa Kỳ) để ghi hình và phân tích các hoạt động của chuột với các bài tập trong môi trường mở, nhận thức đồ vật và trong mê lộ nước. Phần mềm dựa vào sự khác biệt giữa hỡnh ảnh của động vật sỏng màu (trắng) tương phản rừ với hỡnh nền (môi trường thí nghiệm) tối màu (đen), cũng như phân tích sự khác biệt giữa các khung hình theo thời gian trong băng hình (hình nền cố định, động vật chuyển động), xác định tọa độ của chuột theo thời gian (tần số quét 30 hình/giây), cho ra vị trí tương đối của chuột cùng các thông số về thời gian, quãng đường và vận tốc, biểu đạt cho hành vi của chúng ở các vùng được đặt định (Hình 2.3).
Hình 2.3. Giao diện hệ thống ghi có hình ảnh môi trường và chuột (phải) và thông tin phân tích hành vi của Any-Maze (trái).
2.2.3. Quy trình nghiên cứu
Nội dung 1: Gây mô hình béo phì thực nghiệm trên chuột cống trắng và đánh giá hành vi và chuyển hóa lipid trên động vật gây mô hình.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi gây mô hình béo phì bằng thức ăn cao năng giàu chất béo, theo quy trình mô tả ngay sau. Sau thời gian làm quen, chuột được nuôi riêng mỗi con một chuồng. 72 chuột cống trắng được chia đều ngẫu nhiên theo chế độ ăn thường và ăn giàu chất béo. Nhóm ăn chế độ thường với tỷ lệ chất béo chiếm 15,1% tổng năng lượng thức ăn. Nhóm gây béo phì được ăn thức ăn cao năng giàu chất béo (mỡ và cholesterol chiếm 38,9% tổng năng lượng thức ăn). Giai đoạn này chuột được nuôi trong 7 tuần để chuẩn bị cho giai đoạn can thiệp đánh giá tác động của lovastatin. Đánh giá ở giai đoạn này gồm các chỉ số đo sinh trắc, xét nghiệm máu, tiêu thụ thức ăn, phân tích mô bệnh học và đánh giá hành vi động vật sau giai đoạn mô hình.
2.2.3.1. Đo các chỉ số sinh trắc và lượng thức ăn, nước uống
Các chỉ số sinh trắc gồm: cân nặng, chiều dài, vòng ngực và vòng bụng của chuột, được đo ở thời điểm bắt đầu thực nghiệm và đo theo dừi hai lần mỗi tuần trong suốt 7 tuần gây mô hình và 3 tuần/lần trong suốt 12 tuần can thiệp tiếp sau [115], [116], [124], [138]. Chiều dài, vòng ngực và vòng bụng của chuột được đo theo Novelli và cs. (2007) [124]. Trong đó, chiều dài được đo từ mũi đến khấu đuôi khi động vật ở trạng thái thư giãn, vòng ngực được đo vị trí vòng qua ngực sát dưới hai chân trước và vòng bụng của chuột được đo vị trí vòng qua bụng phía trên sát hai chân sau, tính theo đơn vị là cm.
Chỉ số lượng thức ăn tiêu thụ về thức ăn và nước uống (thức ăn mới và còn lại; nước uống mới và còn lại) của chuột được cân đo đều kỳ mỗi tuần hai lần trong suốt hai giai đoạn nghiên cứu, từ đó xác định được lượng tiêu thụ trung bình theo ngày của từng thời đoạn trong từng tuần [115], [117], [121].
2.2.3.2. Phân tích lipid và glucose máu
Các chỉ số sinh hóa máu bao gồm: glucose máu, triglycerid và cholesterol máu, HDL-C và LDL-C. Định lượng glucose, cholesterol và triglycerid máu cuối các tuần 2, 4, 6 và 7 của giai đoạn gây mô hình và cuối các tuần 3, 6, 9 và 12 của giai đoạn can thiệp [116], [117]. Nồng độ HDL-C
và LDL-C máu được lấy xét nghiệm ở ba thời điểm: bắt đầu, cuối tuần 7 gây mô hình và cuối tuần 12 can thiệp ở tất cả các nhóm nghiên cứu. Đêm hôm trước tiến hành cắt thức ăn, ngày hôm sau máu chuột được lấy ở mạch máu của hốc mắt dưới gây mê bằng ketamin vào thời điểm 8-9 giờ sáng các ngày dự định tại Bộ môn Sinh lý học, HVQY. Sau lấy, máu được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút x10 phút để loại bỏ hoàn toàn huyết cầu và lưu trữ trong tủ -70 oC để cho phân tích. Lấy phần huyết tương đưa vào máy sinh hóa tự động Ebra XL-180 để định lượng các chỉ số theo quy trình xét nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Y Sinh Dược học Quân sự, HVQY.
*Nguyên lý xét nghiệm glucose: glucose được phosphoryl hóa bởi men hexokinase (HK) với sự có mặt của adenosine triphosphate (ATP) tạo ra glucose-6-phosphate và adenosine diphosphate (ADP). Với sự có mặt của nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), sau đó enzym glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6P-DH) sẽ oxy hóa glucose-6-phosphate thành gluconate-6- phosphate đồng thời chuyển NAD+ thành NADH. Sự tăng nồng độ NADH là tương ứng trực tiếp với nồng độ glucose và được đo quang phổ ở 340 nm.
*Nguyên lý xét nghiệm cholesterol: cholesterol được đo bằng phương pháp enzym trong huyết tương hoặc huyết thanh theo một loạt các phản ứng kết cặp qua thủy phân cholesteryl ester và oxy hóa nhóm 3-OH của cholesterol. Một trong các sản phẩm của phản ứng là H2O2 được định lượng trong phản ứng được xúc tác bởi peroxidase tạo màu. Hấp phụ được đo ở 500 nm. Mật độ màu tỷ lệ với nồng độ cholesterol.
Các phương trình phản ứng như sau:
cholesterol este + H2O cholesterol ester hydrolase cholesterol + acid béo cholesterol + O2 cholesterol oxidase cholestene 4-en-3-one + H2O2
2 H2O2 + 4-aminoantipyrine + Phenol
peroxidase 4-(p-benzoquinone-
monoimino)-phenazone + 4 H2O
*Nguyên lý xét nghiệm tryglycerit: triglyceride được đo theo phương pháp enzym trong huyết tương hoặc huyết thanh sử dụng một loạt các phản ứng kết cặp trong đó triglycerid được thủy phân hóa thành glicerol. Glycerol sau đó được oxy hóa sử dụng glicerol oxidase và H2O2, một trong các sản phẩm của phản ứng, được đo như mô tả ở phần trên cho colesterol. Hấp phụ được đo tại 500 nm.
Các phương trình phản ứng như sau:
Triglyceride + 3 H2O Lipase Glycerol + 3 axit béo
Glycerol + ATP glycerokinase, Mg++ Glycerol-3-phosphate + ADP
Glycerol-3-phosphate + O2glycerophosphate oxidase Dihydroxyacetone phosphate + H2O2
H2O2 + 4-aminophenazone + 4-chlorophenol
peroxidase 4-(p-benzoquinone-monoimino)- phenazone + 2H2O + HCl
*Nguyên lý xét nghiệm HDL-C: HDL-C được đo trực tiếp trong huyết thanh. Nguyên lý cơ bản của phương pháp là như sau. Các lipoprotein chứa apoB trong mẫu vật được phản ứng với một chất ngăn chặn làm cản trở chúng không phản ứng với chất phản ứng enzym colesterol theo các điều kiện của xét nghiệm. Các lipoprotein chứa apoB như vậy được loại khỏi xét nghiệm vf chỉ có HDL-cholesterol được phát hiện trong các điều kiện của xét nghiệm.
Phương pháp sử dụng sulfated alpha-cyclodextrin với sự có mặt của Mg+2, tạo thành các phức hợp lipoprotein chứa apoB và polyethylene glycol- coupled cholesteryl esterase và cholesterol oxidase cho việc đo nồng độ HDL- cholesterol.
Các phương trình phản ứng như sau:
(1) Các lipoprotein chứa ApoB + α- cyclodextrin + Mg+2 + dextran SO4
Các phức chất không phản ứng với các lipoprotein chứa apoB
(2) HDL-cholesteryl esters PEG-cholesteryl esterase HDL-unesterified cholesterol + fatty acid (3) chol không ester hóa + O2 PEG-cholesterol oxidase cholestenone + H2O2
(4) H2O2 + 5-aminophenazone + N-ethyl-N-(3-methylphenyl)- N’_succinyl ethylene diamine + H2O + H+ peroxidase
quinoneimine dye + H2O
Đậm độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ HDL-cholesterol có trong mẫu thử và được đo bằng máy đo quang ở bước sóng 600 nm.
*Nguyên lý xét nghiệm LDL-C: Phần lớn cholesterol lưu hành trong máu được thấy ở ba phần lipoprotein chính: lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL), LDL và HDL.
[chol tổng] = [VLDL-chol] + [LDL-chol] + [HDL-chol]
LDL-cholesterol được tính từ các giá trị của cholesterol tổng, triglycerid và HDL-cholesterol theo quan hệ:
[LDL-chol] = [chol tổng] - [HDL-chol] - [TG]/5
Trong đó [TG]/5 được ước tính cho VLDL-cholesterol và tất cả các giá trị được biểu thị bằng mg/dL.
Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi và rối loạn chuyển hóa lipid của phức hợp nano alginate/chitosan/lovastatin trên chuột cống được gây béo phì. Chuột ăn chế độ ăn thường hoặc ăn chế độ giàu chất béo được cho uống một trong các chất gồm lovastatin, Nano/Lovastatin, hoặc nước muối sinh lý, thành 6 nhóm chuột nghiên cứu tương ứng với chất được sử dụng trong giai đoạn can thiệp (xem 2.1). Đo các chỉ số sinh trắc, tiêu thụ thức ăn, định lượng glucose và lipid máu như mô tả ở trên. Các hành vi của chuột được đánh giá ở những ngày cuối kết thúc giai đoạn can thiệp, theo trình tự các bài tập: vận động tự phát trong môi trường mở, bài tập nhận thức đồ vật và đánh giá hoạt động học tập qua bài tập mê lộ nước. Động vật sau kết thúc can thiệp được phẫu thuật và cân trọng lượng các tạng.
2.2.3.3. Quy trình các bài tập đánh giá hành vi chuột gây mô hình béo phì Bài tập vận động, khám phá trong môi trường mở: trong bài tập này, thiết lập chương trình Any-Maze để phân môi trường mở thành vùng trung tâm (đường kính 25 cm) và vùng ngoại vi. Chuột được đặt vào trung tâm của môi trường mở để tự do khám phá trong thời gian 5 phút [22], [53], [140].
Môi trường mở được làm sạch và để khô sau mỗi lần thực nghiệm. Hoạt động của chuột được phần mềm ghi hình và phân tích, đưa ra các chỉ số gồm:
quãng đường vận động (cm) - là chiều dài quãng đường chuột di chuyển trong
môi trường mở trong thời gian 5 phút; tốc độ vận động trung bình (cm/giây) - là vận tốc vận động trung bình của chuột trong môi trường mở; thời gian vận động ở các vùng (giây) và số lần vào các vùng trung tâm và ngoại vi - là tổng thời gian chuột vận động ở các vùng và số lần chuột vào các vùng tương ứng (Hình 2.2A).
Bài tập nhận thức đồ vật: đánh giá hành vi khám phá và ghi nhớ các đồ vật mới được đặt bên trong môi trường mở [135]. Thực nghiệm được tiến hành qua 3 phiên (mỗi phiên 5 phút), giữa mỗi phiên tập chuột được tạm nghỉ trong một chuồng nhỏ đặt cạnh môi trường mở:
- Phiên làm quen: chuột được đưa vào môi trường trống và được cho tự do khám phá, làm quen với môi trường mở (Hình 2.4A). Phiên này cũng chính là phần bài tập vận động tự do đã được mô tả ở trên.
- Phiên luyện tập: đặt hai đồ vật giống hệt nhau về hình dáng, chất liệu, màu sắc trong môi trường mở và chuột được tự do khám phá, thăm dò và ghi nhớ môi trường (Hình 2.4B).
- Phiên đánh giá: một trong hai đồ vật được thay mới bằng vật có hình dáng khác biệt nhưng cùng chất liệu, màu sắc. Chuột được tự do khám phá môi trường, thăm dò đồ vật cũ và mới (Hình 2.4C).
Hình 2.4. Các bài tập vận động và nhận thức đồ vật trong môi trường mở.
(A) Vận động khám phá và đồng thời là phiên làm quen với môi trường mở trong bài tập nhận thức đồ vật. Phần kẻ sọc – vùng trung tâm; nét gạch đứt – đường minh hoạ đánh dấu tuyến vận động của động vật. (B) Phiên luyện tập với hai đồ vật giống nhau (hình nón).
(C) Phiên đánh giá với một đồ vật mới (hình người tuyết, bên trái).
Trong các phiên luyện tập và phiên đánh giá, các đồ vật được làm bằng nhựa ABS trắng, gồm hai vật hình nón giống nhau và một vật hình người tuyết có cùng kích thước về chiều cao và đường kính đáy. Chuột được xác định có hoạt động
khám phá đồ vật khi đầu chúng nằm trong một vòng ở khoảng 5 cm bao quanh đáy của các vật thể. Khả năng nhớ và nhận ra đồ vật quen và đồ vật mới được thể hiện qua số lần chuột khám phá đồ vật và chỉ số thời gian khám phá - được xác định bằng tỷ lệ (%) thời gian khám phá đồ vật trên tổng thời gian khám phá các vật thể.
Bài tập trong mê lộ nước: chuột được làm quen với mê lộ nước [131], [132], [133], [139] và được huấn luyện và đánh giá trong 7 ngày liên tiếp, ngày 4 lần, thời gian mỗi lần tối đa là 60 giây. Ngày đầu tiên chuột được thả vào từng góc phần tư với đầu hướng vào phía thành mê lộ để cho bơi tự do. Trong 60 giây nếu chuột tìm được bến đỗ thì được ở lại đó 10 giây, sau đó tiến hành các lần tập tiếp theo. Nếu sau 60 giây chuột không tìm được bến đỗ thì hướng dẫn cho chuột lên bến đỗ và để chuột ở lại đó 10 giây, sau đó tiến hành các lần tập tiếp theo. Ở ngày tập thứ 7, nhấc bến đỗ ra khỏi mê lộ nước, thả chuột vào một góc phần tư bất kỳ và để chuột bơi trong 60 giây. Các chỉ số nghiên cứu gồm: thời gian (giây), quãng đường (cm), vận tốc bơi (cm/giây) để tìm bến đỗ theo ngày; tỷ lệ % tìm được bến đỗ (đánh giá là tìm được khi thời gian bơi tìm đến bến đỗ dưới 60 giây và không tìm được khi thời gian bơi tìm đến bến đỗ qua 60 giây; và thời gian bơi (giây) ở từng góc phần tư ở ngày thử với bến đỗ được nhấc bỏ [134].
2.2.3.4. Quy trình cân tạng động vật và làm mô bệnh học
Chuột sau khi thí nghiệm được gây mê với ketamin liều cao. Phẫu thuật mở bụng theo đường trắng giữa trên và dưới rốn. Bộc lộ và lấy toàn bộ gan, lách, thận và tim ra khỏi cơ thể động vật. Nội tạng sau đó được rửa nhẹ nhàng bằng dung dịch nước muối 0,9% và được thấm khô bằng giấy lọc. Sau đó trọng lượng các tạng được cân tươi và một phần cho vào ống nghiệm giữ ở nhiệt độ âm sâu (-80
oC) với nitơ lỏng để lưu trữ [121], một phần được cho cố định vào trong dung dịch formol nồng độ 10% bảo quản để làm tiêu bản mô bệnh học theo quy trình của Bộ môn Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y.