Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan và các cộng sự (1990). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Cách pha mẫu: lấy 30 l (30 mg) mẫu + với 30 l DMSO pha thành dung dịch mẫu gốc (khoảng 500 mg/mL). Sau đó lấy 20 ul mẫu gốc pha với 80 l H2O được nồng độ 100 mg/mL, các nồng độ sau pha loãng 5 lần bằng H2O được nồng độ 20, 4, 0.8 mg/mL trong đĩa pha mẫu. Trong đĩa thử, mẫu tiếp tục được pha loãng 20 lần để được nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml, 1 mg/ml, 0.2 mg/ml và 0.04 mg/ml;
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này và ủ trong tủ ấm 72 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng axit trichloracetic – TCA 20%.
- Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng axit acetic rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
- 10 mM tris(hydroxymethyl)aminometan để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút.
- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515 – 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% ức chế = 100% -
[OD(chấtthử) - OD(ngày 0)] x 100
OD(đốichứngâm) - OD(ngày 0)
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10, 2, 0.4 và 0.08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Từ các phân tích ở trên, nhận thấy tiềm năng trong việc kết hợp các phối tử NHC với các phối tử có hoạt tính sinh học tốt như thiosemicacbazon, chúng tôi tập trung nghiên cứu phức chất platin(II) và palađi(II) với phối tử benzimidazonlin-2- ylidene và thiosemicacbazon.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Tổng hợp phức chất hỗn hợp của Pt(II) và Pd(II) với N,N-diisopropyl benzimidazolin-2-ylidene và các phối tử trên cơ sở thiosemicacbazon benzandehit, N(4)-metyl thiosemicacbazon benzandehit, N(4)-metyl thiosemicacbazon mesitaldehit, N(4)-metyl thiosemicacbazon aceton, N(4)-etyl thiosemicacbazon aceton, thiosemicacbazon aceton, N(4)-phenyl thiosemicacbazon aceton.
- Nghiên cứu cấu trúc của các phức chất bằng các phương pháp phổ 1H NMR,
13C NMR, HMBC và phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
- Xác định khả năng cho điện tử của phối tử thiosemicacbazon sử dụng đầu dò là PdBr(iPr2-bimy).
- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phức chất đã tổng hợp với dòng MCF-7.
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
Trong luận văn này, để xác định công thức phân tử và công thức cấu tạo của phối tử và phức chất đã tổng hợp được, chúng tôi sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, phổ 13C, phổ hai chiều HMBC và nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
Để đánh giá khả năng cho điện tử của các phối tử trong luận văn, chúng tôi sử dụng thông số HEP2 (dựa trên độ chuyển dịch hóa học 13C của Ccarbene) trong các phức chất [PdBr(iPr2-bimy)(NS)], với NS là các phối tử hai càng trên cơ sở thiosemicacbazon đã tổng hợp.
Để thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phức chất tổng hợp được, chúng tôi sử dụng phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện
Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận tại viện Công nghệ sinh học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Các điều kiện ghi phổ:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của phức chất được ghi trên máy Brucker-500 MHz ở 300K, dung môi CDCl3 tại Khoa hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể được ghi trên máy Bruker D8 Quest ở nhiệt độ 100 K, đối âm cực Mo với bước sóng Kα (λ = 0,71073 Å), tại Bộ môn Hóa vô cơ, Khoa hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Thực nghiệm
Các hóa chất được sử dụng trong quá trình tổng hợp (thiosemicarbazit, N(4) – metyl thiosemicarbazit, N(4) – etyl thiosemicarbazit, N(4) – phenyl thiosemicarbazit, benzanđehit, mesitalđehit) đều là các hóa chất tinh khiết phân tích (AR), sản xuất tại Trung Quốc và Đức. Các dung môi được sử dụng (aceton, metanol, etanol, diclometan) đều là các hóa chất tinh khiết phân tích (AR) của Trung Quốc. Các dụng cụ thí nghiệm và quá trình tổng hợp được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa học phức chất, Bộ môn Hóa vô cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Các phức chất đime của carbene Pd2L2Br4 và Pt2L2Br4 được tổng hợp theo quy trình của tài liệu [5].
2.2.1. Tổng hợp phối tử thiosemicacbazon
Các thiosemicacbazon được tổng hợp thông qua phản ứng ngưng tụ giữa thiosemicacbazit hay sản phẩm thế của nó và các hợp chất cacbonyl (tỉ lệ mol 1:1) theo các quy trình cụ thể [6] như sau:
- Tổng hợp N(4)-metyl thiosemicacbazon aceton (Atm), N(4)-phenyl thiosemicacbazon aceton (Atp), thiosemicacbazon aceton (At):
Nhỏ từ từ 10 ml aceton vào 210 mg (2 mmol) N(4)-metyl thiosemicarbazit (hoặc 334 mg (2 mmol) N(4)-phenyl thiosemicarbazit hoặc 182 mg (2 mmol) thiosemicarbazit). Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trên máy khuấy từ trong 2
giờ. Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, hỗn hợp sau phản ứng được loại dung môi bằng phương pháp cất quay thu được chất rắn màu trắng tinh khiết. Sản phẩm được làm khô trong chân không đến khối lượng không đổi trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất tổng hợp lần lượt là 80%, 85%, 77%.
- Tổng hợp thiosemicacbazon benzandehit (Bt) và N(4)-metyl thiosemicacbazon benzandehit (Btm):
Hoà tan 182 mg (2 mmol) thiosemicarbazit (hoặc 210 mg (2 mmol) N(4)-metyl thiosemicarbazit) trong 15 ml nước đã được axit hoá bằng dung dịch HCl sao cho môi trường có pH = 1 – 2. Sau đó đổ từ từ dung dịch này vào 15 ml dung dịch etanol đã hoà tan 0.2 ml benzanđehit (2 mmol, d = 1.044 g/ml). Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trên máy khuấy từ trong 2 giờ. Khi đó từ dung dịch sẽ tách ra kết tủa màu trắng. Lọc kết tủa trên phễu lọc đáy thuỷ tinh xốp, rửa lần lượt bằng nước, hỗn hợp rượu - nước, rượu, cuối cùng bằng đietyl ete. Sản phẩm được làm khô trong chân không đến khối lượng không đổi trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất tổng hợp lần lượt là 80% và 82%.
- Tổng hợp N(4)-metyl thiosemicacbazon mesitaldehit (Mtm):
Hoà tan 210 mg (2 mmol) N(4)-metyl thiosemicarbazit trong 15 ml nước đã được axit hoá bằng dung dịch HCl sao cho môi trường có pH = 1 – 2. Sau đó đổ từ từ dung dịch này vào 15 ml dung dịch etanol đã hoà tan 0.3 ml mesitalđehit (2 mmol, d
= 1.0225 g/ml). Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trên máy khuấy từ trong 2 giờ. Khi đó từ dung dịch sẽ tách ra kết tủa màu trắng. Lọc kết tủa trên phễu lọc đáy thuỷ tinh xốp, rửa lần lượt bằng nước, hỗn hợp rượu - nước, rượu, cuối cùng bằng đietyl ete. Sản phẩm được làm khô trong chân không đến khối lượng không đổi trước khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất tổng hợp đạt 75%.
2.2.2. Tổng hợp phức chất
- Tổng hợp phức chất [PdBr(Atm)(iPr2-bimy)] (A):
Khuấy đều hỗn hợp bao gồm 188 mg đime Pd2L2Br4 (0.2 mmol) và 104 mg AgOTF (0.4 mmol) trong 1 ml acetonitrile và 10 ml diclometan trong vòng 2 giờ sẽ tạo ra kết tủa màu vàng nhạt. Lọc bỏ kết tủa sẽ thu được dung dịch không màu. Hoà tan
hoàn toàn hỗn hợp gồm 58 mg phối tử Atm (0.4 mmol) trong 10 ml dung dịch metanol, điều chỉnh pH bằng 27.6 mg K2CO3 (0,2 mmol). Sau đó, vừa đổ vừa khuấy đều hai hỗn hợp trên bằng máy khuấy từ trong vòng 2h sẽ thu được dung dịch màu vàng rơm. Kiểm tra độ tinh khiết của dung dịch thu được bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC). Phức chất A được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với hệ dung môi TG-diclometan và TG-etyl axetat (tỉ lệ thể tích 5:1). Dung dịch tinh khiết thu được sau chạy cột được loại dung môi bằng phương pháp cất quay và rửa sản phẩm bằng cloroform. Làm khô đến khối lượng không đổi trong chân không thu được chất rắn màu vàng để tiến hành nghiên cứu phức chất. Hiệu suất tổng hợp đạt 60%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.47-7.49 (m, 2H, Ar-H), 7.12-7.14 (m, 2H,
Ar-H), 6.08-6.13 (sept, 2H, CH(CH3)2), 4.43 (br.s, 1H, NHCH3), 2.81-2.82 (d, 3H, NHCH3), 2.63 (s, 3H, N=C(CH3)2), 2.09 (s, 3H, N=C(CH3)2), 1.68-1.69 (d, 3H, CH(CH3)2), 1.63-1.65 (d, 3H, CH(CH3)2). 13C NMR (CDCl3, 127.6 MHz): δ 171.3 (N=C(CH3)2), 168.7 (SC=N), 166.8 (NCN), 134.1, 122.8, 113.1 (Ar-C), 55.0 (2C, CH(CH3)2), 32.8 (1C, N=C(CH3)2), 30.2 (1C, N=C(CH3)2), 22.3 (NHCH3), 21.1- 21.5 (4C, CH(CH3)2). Đơn tinh thể của phức chất thu được khi cho bay hơi chậm dung dịch bão hòa của phức chất trong hệ dung môi methanol/cloroform.
- Tổng hợp phức chất [PdBr(At)(iPr2-bimy)] (B):
Phức chất B được tổng hợp và làm sạch với quy trình tương tự như phức chất A, khi sử dụng 188 mg đime Pd2L2Br4 (0.2 mmol), 104 mg AgOTF (0.4 mmol), 53 mg phối tử At (0.4 mmol). Phức chất B được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với hệ dung môi TG-diclometan và TG-etyl axetat (tỉ lệ thể tích 4:1). Hiệu suất tổng hợp đạt 79%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.48-7.51 (m, 2H, Ar-H), 7.14-7.16 (m, 2H, Ar-H), 6.03-6.12 (sept, 2H, CH(CH3)2), 5.28 (br.s, 1H, NH2), 2.64 (s, 3H, N=C(CH3)2), 2.11 (s, 3H, N=C(CH3)2), 1.68-1.69 (d, 3H, CH(CH3)2), 1.64-1.65 (d, 3H, CH(CH3)2). 13C NMR (CDCl3, 127.6 MHz): δ 172.7 (N=C(CH3)2), 171.2 (SC=N), 164.6 (NCN), 134.1, 123.1, 113.2 (Ar-C), 55.1 (2C, CH(CH3)2), 30.4 (1C, N=C(CH3)2), 22.6 (1C, N=C(CH3)2), 21.1-21.6 (4C, CH(CH3)2). Đơn tinh thể của
phức chất thu được khi cho bay hơi chậm dung dịch bão hòa của phức chất trong hệ dung môi diclometan/hexan.
- Tổng hợp phức chất [PdBr(Atp)(iPr2-bimy)] (C):
Phức chất C được tổng hợp và làm sạch với quy trình tương tự như phức chất A, khi sử dụng 188 mg đime Pd2L2Br4 (0.2 mmol), 104 mg AgOTF (0.4 mmol), 83 mg phối tử Atp (0.4 mmol). Phức chất C được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với hệ dung môi TG-diclometan và TG-hexan (tỉ lệ thể tích 5:1). Hiệu suất tổng hợp đạt 50%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.50-7.51 (m, 2H, Ar-H), 7.40-7.41 (m, 2H,
Ar-H), 7.15-7.21 (m, 4H, Ar-H), 6.89-6.92 (m, 1H, Ar-H), 6.06-6.15 (sept, 2H, CH(CH3)2), 5.22 (br.s, 1H, NHPh), 2.72 (s, 3H, N=C(CH3)2), 2.19 (s, 3H, N=C(CH3)2), 1.66-1.71 (d, 6H, CH(CH3)2). 13C NMR (CDCl3, 127.6 MHz): δ 173.7 (N=C(CH3)2), 166.0 (NCN), 165.1 (SC=N), 141.3, 134.2, 129.4, 123.0, 122.8, 119.5, 113.3 (Ar-C), 55.1 (2C, CH(CH3)2), 30.3-30.5 (1C, N=C(CH3)2), 23.3 (1C, N=C(CH3)2), 21.2-21.6 (4C, CH(CH3)2). Đơn tinh thể của phức chất thu được khi cho bay hơi chậm dung dịch bão hòa của phức chất trong hệ dung môi diclometan/hexan.
- Tổng hợp phức chất [PdBr(Bt)(iPr2-bimy)] (D):
Hoà tan hoàn toàn hỗn hợp gồm 72 mg phối tử Bt (0.4 mmol) và 188 mg đime Pd2L2Br4 (0.2 mmol) trong 20 ml aceton, trong sự có mặt của NaOH (1 eq). Khuấy đều hỗn hợp trên máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng, khi thấy hỗn hợp chất rắn tan hết thì đun hồi lưu ở nhiệt độ 60-70°C trong 12 giờ sẽ thu được dung dịch màu vàng đậm. Kiểm tra độ tinh khiết của dung dịch thu được bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC). Phức chất D được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với dung môi TG-diclometan. Dung dịch tinh khiết thu được sau chạy cột được loại dung môi bằng phương pháp cất quay và rửa bằng cloroform. Làm khô sản phẩm đến khối lượng không đổi trong chân không sẽ thu được chất rắn màu vàng. Hiệu suất tổng hợp đạt 65%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.57 (s, 1H, NCH), 8.10 – 8.12 (m, 2H, Ar-H), 7.52-7.54 (m, 2H, Ar-H), 7.34 (m, 3H, Ar-H), 7.16-7.19 (m, 2H, Ar-H), 6.01 (sept, 2H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz), 4.93 (br.s, 2H, NH2), 1.69-1.70 (d, 3H,
CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz), 1.63-1.65 (d, 3H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz). 13C NMR (CDCl3, 127.6 MHz): δ 177.0 (N=CHPh), 167.1 (NCN), 156.0 (SC=N), 134.7, 133.3, 133.3, 131.4, 128.8, 123.1, 113.4, 30.3 (Ar-C), 55.2 (2C, CH(CH3)2), 21.2- 21.6 (4C, CH(CH3)2). Đơn tinh thể của phức chất thu được khi cho bay hơi chậm dung dịch bão hòa của phức chất trong hệ dung môi diclometan/hexan.
- Tổng hợp phức chất [PdBr(Btm)(iPr2-bimy)] (E):
Phức chất E được tổng hợp và làm sạch với quy trình tương tự như phức chất D, khi sử dụng 77 mg phối tử Btm (0.4 mmol) và 188 mg đime Pd2L2Br4 (0.2 mmol). Phức chất E được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với dung môi TG-diclometan.
Hiệu suất tổng hợp đạt 65%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.57 (s, 1H, NCH), 8.19 – 8.20 (m, 2H, Ar-H), 7.51-7.53 (m, 2H, Ar-H), 7.34-7.35 (m, 3H, Ar-H), 7.15-7.19 (m, 2H, Ar-H), 6.02 (sept, 2H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz), 4.87 (br.s, 1H, NHCH3), 2.99-3.00 (d, 3H, NHCH3), 1.68-1.70 (d, 3H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz), 1.63-1.64 (d, 3H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz). 13C NMR (CDCl3, 127.6 MHz): δ 167.7 (NCN), 155.2 (SC=N), 134.4, 133.4, 131.1, 128.7, 123.0, 113.3 (Ar-C), 55.2 (2C, CH(CH3)2), 30.3 (NHCH3), 21.3-21.6 (4C, CH(CH3)2). Đơn tinh thể của phức chất thu được khi cho bay hơi chậm dung dịch bão hòa của phức chất trong hệ dung môi diclometan/hexan.
- Tổng hợp phức chất [PdBr(Mtm)(iPr2-bimy)] (F):
Phức chất F được tổng hợp và làm sạch với quy trình tương tự như phức chất D, sử dụng 94 mg phối tử Mtm (0.4 mmol) và 188 mg đime Pd2L2Br4 (0.2 mmol). Phức chất F được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với dung môi TG-diclometan.
Hiệu suất tổng hợp đạt 60%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.75 (s, 1H, NCH), 7.50-7.52 (m, 2H, Ar-H), 7.14-7.16 (m, 2H, Ar-H), 6.76 (m, 2H, Ar-H), 6.03 (sept, 2H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz), 5.20 (br.s, 1H, NHCH3), 2.70-2.71 (d, 3H, NHCH3), 2.19-2.20 (m, 9H, C6H2(CH3)3), 1.69-1.70 (d, 3H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz), 1.63- 1.65 (d, 3H, CH(CH3)2, 3JH,H = 7 Hz). 13C NMR (CDCl3, 127.6 MHz): δ 168.1 (N=CH), 163.0 (NCN), 158.1 (SC=N), 138.7, 136.6, 134.2, 131.6, 128.3, 122.9,
113.2 (Ar-C), 55.0 (2C, CH(CH3)2), 21.7 (Ar-(CH3)3), 21.5 (NHCH3), 21.0-21.2 (4C, CH(CH3)2).
- Tổng hợp phức chất [PtBr(Atm)(iPr2-bimy)] (G):
Phức chất G được tổng hợp và làm sạch với quy trình tương tự như phức chất A, sử dụng 58 mg phối tử Atm (0.4 mmol) và 223 mg đime Pt2L2Br4 (0.2 mmol). Phức chất G được tinh chế bằng phương pháp sắc kí cột với hệ dung môi TG-diclometan và TG-etyl axetat (tỉ lệ thể tích 20:1). Sản phẩm thu được là chất rắn màu trắng, hiệu suất tổng hợp đạt 65%. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.49-7.51 (m, 2H, Ar- H), 7.11-7.13 (m, 2H, Ar-H), 6.88-6.37 (sept, 2H, CH(CH3)2), 4.05 (br.s, 1H, NHCH3), 2.84-2.85 (d, 3H, NHCH3), 2.73 (s, 3H, N=C(CH3)2), 2.17 (s, 3H, N=C(CH3)2), 1.66-1.67 (d, 3H, CH(CH3)2), 1.60-1.62 (d, 3H, CH(CH3)2).