2.1.1. Mẫu máu
* Số lượng, phương thức lấy mẫu:
Chọn lọc mâu : 208 mẫu máu, trong đó có 8 mẫu máu của người thường không mang bệnh (mẫu 37, 38, 39 và mẫu 204 đến 208) và 200 mẫu máu của bệnh nhân
đươc chẩn đoán AML taị Viên Huyết ho ̣ c và Truyền máu Trung ương . Tiêu chuẩn chẩn đoán AML: blast trong máu hoăc tủy > 20%, hình thái học và hóa học tế bào thuộc AML (M0-M7 theo tiêu chuẩn FAB ), quần thể blast mang c ác marker dòng tủy. Tiêu chuẩn chon mâ
u : 1-2 ml dic ̣ h tủy
hoăc máu lấy từ bêṇ h nhân đã đươc chẩn đoán AML. Mẫu máu sau khi lấy về được chia vào các ống eppendorf 1,5ml, mỗi ống 200àl, được bảo quản ở -20oC.
2.1.2. Các hóa chất và bộ kit
Các hóa chất và bộ kit được đặt mua từ các hãng hóa chất uy tín dành cho nghiên cứu sinh học phân tử.
Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn
- Dung dịch I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0 - Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N
- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH3COOK 0,2M pH 4,8 - RNase 10mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0 - Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20oC), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC) - Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0
Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) - PCR buffer Taq DNA polymerase 10X
- PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X - Dung dịch MgCl2, MgSO4 25mM
- dNTP 8mM
- Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R - Nước cất (ddH2O)
Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose - Agarose (Sigma), Safe View
- Ethidium bromide 10mg/ml,
- Dung dịch điện di TAE (Tris-base, acetic acid, EDTA 500 mM).
- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%, bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% và EDTA 60mM).
Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen - Xgal, IPTG 100mM
- Dung dịch TE, Tris 1M
- Môi trường TSA, môi trường LB - Kháng sinh: ampicillin
2.1.3. Máy móc và thiết bị
Máy móc thiết bị phục vụ cho các thí nghiệm thuộc phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học; phòng Protein tái tổ hợp, thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Máy điều khiển nhiệt theo chu kì PCR PTC-100 (Bio-rad) - Bộ điện di đứng loại nhỏ Mini-Protean Tetra Cell
- Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology) - Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V) - Bộ điện di protein (Biorad)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich Centrifugen) - Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific)
- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences) - Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)
- Máy Vortex (IKA, Mỹ) - Máy đo pH (Orion, Anh)
- Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức) - Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)
- Bể ổn nhiệt (Memmert)
- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ) - Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh )
- Tủ mát 4oC (Nhật ), Tủ lạnh -20oC (Nhật ) 2.2. Phương pháp
2.2.1. Tách DNA tổng số từ mẫu máu
Để thu được DNA tổng số, các mẫu máu được xử lý bằng bộ kit “DNA Blood mini kit” của hãng Qiagen. Mẫu máu khi thu về được chia vào các ống eppendorf 1,5ml, mỗi ống chứa 200àl mẫu.
Đầu tiên, mẫu máu tổng số được loại bỏ các thành phần không phải tế bào như protein và phỏ vỡ tế bào bằng 20àl QIAGEN Protease (or proteinase K), 200àl đệm ALủ mẫu ở 56oC trong 10 phút.
Sau đó, ly tâm nhẹ, bỏ dịch nổi và chuyển vào cột QIAamp mini, bổ sung Ethanol 96o. Tiếp tục ly tâm ở 6000g (8000 rpm) / phút, bỏ dịch và rửa tủa 2 lần với 500àl đệm AW1, và 500àl đệm AW2 trong vũng 3 - 5 phỳt.
Cuối cựng, bổ sung 100 àl nước đó loại bỏ enzyme phõn hủy ADN vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng (15-25oC) 1 phút, sau đó ly tâm ở 6000 g(8000 rpm) trong 1 phút, thu dịch trong ống eppendorf.
Mẫu ADN tổng số sau khi thu được sẽ điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, và đo nồng độ bằng máy đo phổ hấp thụ (nanodrop). Sau đó, được bảo quản ở - 20oC.
2.2.2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến
Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase; còn mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide ngắn được tổng hợp hóa học.
2.2.3. Nhân đoạn gen FLT3chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng chuỗi polymerase(PCR)
DNA tổng số được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng của gen FLT3. Chu trình nhiệt của phản ứng đã tối ưu như sau:
35 chu kì 94 Co
5 phút
94 Co
1 phút
56 Co
30 giây
72 Co
1 phút
72 Co
10 phút
4 Co
Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Mỗi phản ứng PCR gồm cỏc thành phần theo bảng 3 bổ sung thờm 3àl DNA tổng số. Trong đó, các mẫu ADN tổng số được pha về nồng độ ADN trong khoảng từ 40-50 ng/àl. Quỏ trỡnh thao tỏc thực hiện trong điều kiện sạch (cú thể vụ trựng), sau đó nhanh chóng đạt mẫu vào trong máy gia nhiệt PCR.
Bảng 2.1: Thành phẩn của phản ứng PCR đoạn gen FLT3 Thành phần Thể tớch 1 phản ứng (àl)
H20 14.8
Buffer 2.5
dNTPs 2.5
Mồi xuôi 1
Mồi ngược 1
Taq 0.1
2.2.4. Điện di agarose hoặc acrylamide để phân tích phổ băng đột biến
Sản phẩm PCR đoạn gen FLT3 được chạy điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE 1x, hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút đối với bể lớn; và hiệu điện thế 90V trong khoảng 30 phút đối với bể nhỏ.
Đệm TAE 1x có thành phần như sau: Tris HCl 4.48g, EDTA 0.5M (pH 8.0) 2ml, acetic acid 1.14ml, nước cất vừa đủ 1 lít. Hòa tan 2g bột agarose trong 100ml đệm TAE 1x để cho gel agarose 2%.
Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide 1% trong 5-10’ và soi dưới đèn UV của máy soi gel.
Ngoài điện di agarose 2%, tùy theo mục đích, có thể điện di với một số loại gel agarose khác như: agarose metaphor 3%, gel acrylamide 12%...
2.2.6. Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phương pháp Sanger
* Phương pháp ligate và biến nạp
Sau khi điện di, băng ADN có sự chênh lệch kích thước được xác định và cắt riêng ra khỏi bản gel. Sử dụng bộ kít tinh sạch gel của promega, ta sẽ thu được ADN chứa đột biến FLT3. Sản phẩm tinh sạch của băng điện di đột biến gen FLT3 được đưa vào vector pGEM-T Easy thông qua bộ kit “pGEM-T Easy Vector System” của hãng Promega. Phản ứng ligate gồm các thành phần: Enzyme T4 ligase; Đệm của T4 ligase, ADN thôi gel.
Tiếp theo, vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến DH5α và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TSA-ampicilin được trải IPTG và X-gal. Nuôi cấy qua một đêm, sau đó, lựa chọn những khuẩn lạc màu trắng mang PCR và điện di agarose 2% nhằm khẳng định kết quả biến nạp.
Chọn những khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen FLT3 đột biến, nuôi qua đêm trong môi trường LB-ampicillin lỏng. Tinh sạch plasmid từ thể biến nạp thành công và gửi đi giải trình tự ở một số cơ sở.
* Đọc trình tự bằng phương pháp Sanger
Trong phương pháp này, ddNTP(dideoxyribonucleoside triphosphate) tức dNTP mà phân tử được của nó thiếu nhóm 3’- OH được sử dụng. Trong phản ứng tổng hợp PCR, phân tử này vẫn gắn vào gốc của dNTP trước đó bằng liên kết phosphodiester nhưng do không có gốc 3’- OH nên không thể tạo liên kết mới với bất kỳ phân tử dNTP nào khác do đó, phản ứng tổng hợp DNA chấm dứt tại đây.
Trong phản ứng tổng hợp DNA, ngoài dNTPs, cho thêm vào hỗn hợp một dẫn xuất ddNTP, ví dụ thay dATP bằng ddATP, quá trình tổng hợp dừng lại khi ddATP gắn vào sợi DNA đang kéo dài. Như vậy trong hỗn hợp phản ứng sau cùng sẽ thu được nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt và tất cả cúng đều chấm dứt tại vị trí A (do việc gắn ddATP thay vì dATP là ngẫu nhiên). Các sản phầm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát trên gel polyacrylamide biến tính. Kết quả trên trường điện di là các vạch có chiều dài khác nhau và đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn. Phản ứngdiễn ra tương tự với ddGTP, ddTTP và ddCTPtạo ra 4 trường điện di và suy ra trình tự sợi khuôn DNA.
Trong thực tế, các ddNTP này thường được gắn với thuốc nhuộm phát huỳnh quang với các màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Tiến hành phản ứng tổng hợp với cả 4 dNTPs và 4 ddNTPs, sản phẩm của phản ứng được đưa lên máy đọc. Máy đọc sử dụng tia laser để xác định các chất phát huỳnh quang phát ra từ thuốc nhuộm gắn lên sản phẩm và kết quả được chuyển vào máy tính để xử lý và cho ra trình tự cần xác định.
Trong đề tài này, việc đọc trình tự ADN của các băng đột biến được thực hiện theo hai cách: đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm ADN tinh sạch từ gel và đọc trình tự từ plasmid chứa đoạn gen FLT3 mang đột biến đó sau khi nhân dòng.
2.2.7. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn
Ngoài phần mềm excel được sử dụng cho các tính toán thông thường, trong luận văn còn sử dụng một số phần mềm sau:
- Phần mềm BLAST-online: được dùng để chuyển trình tự nucleotid của gen sang trình tự axit amin của protein.
- Phần mềm ImageJ: được sử dụng để đo độ sáng của băng điện di, từ đó suy ra nồng độ của mẫu nghiên cứu.
- Phần mềm MEGA 5.0: được sử dụng để kiểm tra trình tự gen và trình tự protein, kiểm tra độ bắt cặp của các đoạn Nucleotid với nhau, nhằm thiết kế mồi và phát hiện đột biến gen sau khi giải trình tự.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN