Khảo sát điều kiện xử lý mẫu - Nghiên cứu xây dựng- 123docz.net

K ế ế ự ế bằ M OH, E yl , ơ M OH – ƣ ậ y ằ ế đậ M OH M OH – ƣ E yl K ể y ằ sắ ý đồ ủ ị ế x ệ ề ạ , ủ ầ í (BMX, DXA). H 3.3

H Sắ ý đồ ị ế M OH, b M OH – ƣ , Etyl acetat

Dự đặ í b s dexamethason acetat không ƣ ƣ ả ă ò ố l, ặ l l ô ễ b y ơ ô đ ƣ l đƣợ lự l ô xử lý ƣ s ế l ạ ạ bằ ƣ s đ ế lạ bằ M OH T ế ả s bằ ự ệ ổ ờ ế ả ú , ệ đ ế ố đị l o ỏ ơ ệ đ sô ủ l đƣợ lự để xử lý l ạ đƣợ ề ạ y ễ ề H 3.4

H 4 Sắ ý đồ ị l ạ ạ bằ ƣ M ắ ả lậ , b M ử ả lậ

N ậ x t : C ồ ổ ị l ạ ạ bằ ƣ ủ m ắ ả lậ m ử ả lậ cho y sự ố ề ạ ổ ô ệ số Match.

Kết quả : Hệ số x xỉ (0.983) ỉ hai ổ đị í ố hoàn toàn. ể ẳ đị í ử ả lậ ô bị ế ỏ ử l ạ ạ bằ ƣ

Từ ế ả ả s , y xử lý ử đƣợ ƣ s í x ả , b ả lậ đã đƣợ đồ b ú L ẩ bằ l ƣ s đ l ƣ , đ ủy ở o

ú ỉ ả lắ ẹ L bằ y l l ạ bỏ ị ế ƣ G b bã ƣợ l ệ b ú ữ lạ y l lầ l ế T l M OH ế ụ đ ủy ở o ú , ạ l y ị ế T ế ế lầ ữ ử bã ƣợ l ệ l M OH G ả ị ế ị ử đ ô đế ắ bế ủy Hò ắ l đ N- ƣ lệ 7 , yể b b đị ứ l, ử ố ô lầ lầ ả , l đ Tậ ị ử b đị ứ đ đế ừ đủ ể í Hú l b đị ứ l đ đế ừ đủ ể í L l , μ ƣ ệ ố HPL

H 5 Sơ đồ y xử lý

H 6 Sắ ý đồ ị ế M ắ ả lậ ƣ l ạ ạ , b M ắ ả lậ đã l ạ ạ , (c) M ử ả lậ đã l ạ ạ , H ợ ẩ

N ậ x t: Từ sắ ý đồ ủ ị ế l ạ ạ , ị ế ắ ả lậ , ị ế ử ả lậ y

- L ạ ạ bằ ƣ ể l ạ ầ ế ạ ự , l ề ở sạ

- Dị ế ắ ả lậ ô ò ạ ạ ờ lƣ ủ b s x s

- Dị ế ử ả lậ ồ đ ệ í đỉ ủ ẩ ồ đ b s >9 % x s > %

Kết uậ : Q y xử lý y ệ ả bƣ l ạ ạ , y ầ ă lƣợ ô ế ặ ă số lầ ế để đạ ệ ả ơ ằ ế ệ ạ .

ề x ă lƣợ ô ế M OH ừ l lầ l l lầ ô ă số lầ ế để ờ xử lý Q y xử lý đƣợ x y ự lạ ƣ s :

H 7 Q y xử lý ự ệ 3.3. Thẩm định phương pháp

T ế ẩ đị ỉ ƣ ủ AOAC International (2016) [5]

3.3.1. í tươ t í t

Tí í ợ ủ ệ ố đƣợ x đị ự đ lệ ẩ ƣơ đố RSD ủ ệ í ờ lƣ ủ b s x s sắ ý lầ l ế ị ợ ẩ b s x s ồ đ 100 àg/ml ử ả lậ

37 ồ đ l.

 Mẫu uẩ ỗ ợ Bet et so v Dex et so et t

Bả 3.2 Bả ế ả ả s í ƣơ í ệ ố ẩ ợ B s D x s ồ đ l

Betamethason Dexamethason acetat

STT tR S As Rs N STT tR S As Rs N

1 4.193 20755782 1.229 3.193 4056 1 5.56 20549270 1.27 4.566 4619 2 4.193 20973735 1.315 3.193 4137 2 5.567 20257389 1.25 4.699 4731 3 4.193 21202460 1.303 3.193 4050 3 5.573 20820389 1.29 4.573 4666 4 4.193 21183440 1.268 3.193 4087 4 5.56 20859970 1.28 4.56 4659 5 4.193 21072178 1.237 3.193 4061 5 5.567 20719310 1.27 4.567 4654 6 4.2 21122670 1.321 3.2 4108 6 5.573 20740513 1.26 4.573 4716

TB 4.19 21051711 1.28 3.19 4083 TB 5.57 20657807 1.27 4.59 4674 SD 0.003 166844 0.04 0.003 34.23 SD 0.006 223625 0.014 0.054 42 RSD% 0.07 0.79 3.13 0.09 0.84 RSD% 0.11 1.08 1.10 1.18 0.90

Nhận xét: Từ bảng kết quả cho th y:

- RSD% của thông số thờ lƣ % 0.07% %).

- RSD% của diệ í đỉ % 79% 1.08%).

- Hệ số b đố  1.3 (TB = 1.28 1.27) - ả Rs > TB = 9 4.59)

- Số đ lý yết N > 2000 (TB = 4108 74).

Kết luận: Q y đạ í ƣơ í ệ thố ẩ

H 8 Sắ ý đồ ợ ẩ s lầ

 Mẫu t ả l t ỗ ợ Bet et so v Dexamethason acetat

Bả 3.3. Bả ế ả ả s í ƣơ í ệ ố ử ả lậ ẩ ồ đ l

Betamethason Dexamethason acetat

STT tR S As Rs N STT tR S As Rs N

1 4.23 8879885 1.27 3.227 4213 1 5.6 8442728 1.291 4.67 4675 2 4.21 9112610 1.29 3.213 4143 2 5.59 8361911 1.314 4.587 4612 3 4.22 9378775 1.25 3.22 4139 3 5.593 8510333 1.295 4.593 4589 4 4.227 9155442 1.27 3.227 3972 4 5.607 8587956 1.276 4.607 4424 5 4.207 9334437 1.24 3.207 3925 5 5.587 8616548 1.32 4.587 4408 6 4.207 9249278 1.30 3.207 3888 6 5.593 8462062 1.295 4.583 4377

TB 4.217 9185071 1.27 3.22 4047 TB 5.595 8496923 1.299 4.60 4514 SD 0.01 180677 0.022 0.01 135 SD 0.007 95034 0.016 0.03 126 RSD 0.24 1.97 1.73 0.28 3.34 RSD 0.13 1.12 1.23 0.72 2.79

Nhận xét: Từ bảng kết quả cho th y:

- RSD% của thông số thờ lƣ % 24% 13%).

- RSD% của diệ í đỉ % 1.97% ).

- Hệ số b đố  1.3 (TB = 1.27 99 - ả Rs > TB = 2

- Số đ lý yết N > 2000 (TB = 4 7

Kết luậ Q y đạ í ƣơ í ệ thố ử ả lậ

H 9 Sắ ý đồ ử ả lậ ẩ ợ ẩ s lầ 3.3.2. í đặ u

Phân í đồ ờ ồ : dung môi đ , ị ẩ , ắ ả lậ l z b ả lậ ẩ ệ ố HPL , ự ệ ề ả lậ ự ạ Kế ả đƣợ b y

H 10 Sắ ý đồ ính l ủ ƣơ ô đ , b ắ ả lậ , ử ả lậ , ợ ẩ

Kế ả ở y sắ ý đồ ủ ô đ , ắ ả lậ ô x ệ ế ƣơ ứ ế í sắ ý đồ ủ ẩ ử ả lậ ả lậ ẩ

Sắ ý đồ ủ ử ả lậ ế í ạ , ờ lƣ ế í sắ ý đồ ủ ẩ D đ , ƣơ có tính đặ ệu đả bả để ệ x s b s ề đƣợ ả s

3.3.3. í tuyế tí

K ả ồ đ yế í ủ ƣơ đƣợ x đị ự ố ƣơ ồ y ữ ồ đ ệ í ủ x s b s ả ồ đ ả s – l Kế ả đƣợ b y ở 113 và hình 3.12.

H 11. ồ ị ƣơ ữ ồ đ ệ í ủ betamethason

H 12. ồ ị ƣơ ữ ồ đ ệ í ủ dexamethasone acetat

H 13. Sắ ý đồ ế í ủ betamethason dexamethasone acetat Bả 4. Bả í yế í ủ betamethason

Ftn = 39613.63 > F (0.05,1,3) = 10.13 ta = 3.23 > t (0.05,3) = 3.18 tb = 199.03 > t (0.05,3) = 3.18 P ƣơ yế

y = 202855x + 270103

R2 0.9999

Bả 5 Bả í yế í ủ dexamethasone acetat Ftn = 70152.64 > F (0.05,1,3) = 10.13

ta = 7.10 > t (0.05,3) = 3.18 tb = 264.86 > t (0.05,3) = 3.18 P ƣơ yế

í y = 189884x + 418329

R2 1

N ậ x t : Sử ụ s F T để ể y ƣơ yế tí ủ b s x s í ƣơ í , ệ số ệ số b ủ ƣơ đề ý

Kết uậ :

- T ả ồ đ 1 - 125 ệ í ồ đ ủ betamethason dexamethasone acetat ụ yế í ệ số ƣơ quan R2 lầ lƣợt l 0.9999 (betamethason) va 1 (dexamethasone acetat).

- P ƣơ ồ y ủ betamethason đƣợ b ể ễ l : y = 202855x + 270103, R2 = 0.9999

- P ƣơ ồ y ủ dexamethasone acetat đƣợ b ể ễ l y = 189884x + 418329, R2 = 1

3.3.4. át LOD v đị lượ LOQ

Dự đ lệch chuẩn củ đ ứ đ dốc. Gi i hạn phát hiện (LOD) ạ đị lƣợ LOQ có thể đƣợ í ƣ s

T đ σ l đ lệch chuẩn củ đ ứng (Standard Error) S l đ dốc củ đường chuẩn

 Betamethason

 Dexamethasone acetate

3.3.5. í xá tro y

• T ến hành phân tích 6 m u thử ả lậ đ lậ y, ế ả ể ệ ở H 14 bả , bả 7.

Hình 3.14 Sắ ý đồ ủ ị M ử (M1 – M6)

 Betamethason

Bả 6. Kết quả khả s đ í x ủ B s Mẫu

thử

ƣợng mẫu thêm vào

(ppm)

Thời gian lưu tR (ph t)

Diện tích đỉnh S (mAU)

Hệ số bất đối

Độ phân giải Rs

Số đĩa lý thuyết

1 50 4.25 9379885 1.27 3.23 4213

2 50 4.21 9312610 1.28 3.21 4143

3 50 4.22 9478775 1.25 3.22 4139

4 50 4.23 9455442 1.26 3.23 3972

5 50 4.21 9534437 1.24 3.21 3925

6 50 4.21 9449278 1.28 3.21 3888

TB 4.22 9435071 1.26 3.22 4047

SD 0.016 78029 0.016 0.01 135

RSD% 0.38 0.83 1.27 0.31 3.34

N ậ x P ƣơ đ í x AO , đ lệ ẩ ƣơ đố RSD ủ ệ í b s ị ô 7.3%

44 (0.83%).

Bả 7. Kết quả khả s đ í x ủ D x s Mẫu

thử

ƣợng mẫu thêm vào

(ppm)

Thời gian lưu tR

(ph t)

Diện tích đỉnh S (mAU)

Hệ số bất đối

Độ phân giải Rs

Số đĩa lý thuyết

1 50 5.64 8542728 1.29 4.67 4675

2 50 5.59 8561911 1.31 4.59 4612

3 50 5.59 8510333 1.29 4.59 4589

4 50 5.61 8587956 1.28 4.61 4424

5 50 5.59 8616548 1.32 4.59 4408

6 50 5.59 8762062 1.29 4.58 4377

TB 5.60 8596923 1.30 4.60 4514

SD 0.02 88766 0.015 0.033 126

RSD% 0.36 1.03 1.15 0.72 2.79

N x t P ƣơ đ í x AOAC , đ lệ ẩ ƣơ đố RSD ủ ệ ích pic dexamethasone ị ô 7.3%

(1.03%).

Kết uậ : P ƣơ đạ đ í x O 3.3.6. đ

 Betamethason

Bả 3.8. Kết quả lƣợ Bethamethasone y ử ả lậ Mẫu

thử

ƣợng mẫu thêm vào

(ppm)

Thời gian lưu tR

(ph t)

Diện tích đỉnh S (mAU)

ƣợng tìm thấy

(%)

1 50 4.25 9379885 89.82

2 50 4.21 9312610 89.15

3 50 4.22 9478775 90.79

4 50 4.23 9455442 90.56

5 50 4.21 9534437 91.34

6 50 4.21 9449278 90.50

TB 4.22 9435071 90.36

SD 0.016 78029 0.77

RSD% 0.38 0.83 0.85

Bả 3.9. Kết quả lƣợ Dexamethasone acetate y ử ả lậ Mẫu

thử

ƣợng mẫu thêm vào

(ppm)

Thời gian lưu tR (ph t)

Diện tích đỉnh S (mAU)

ƣợng tìm thấy

(%)

1 50 5.64 8542728 85.57

2 50 5.59 8561911 85.77

3 50 5.59 8510333 85.23

4 50 5.61 8587956 86.05

5 50 5.59 8616548 86.35

6 50 5.59 8762062 87.88

TB 5.60 8596923 86.14

SD 0.02 88766 0.93

RSD% 0.36 1.03 1.08

- Lƣợ í y ầ ử đ í x , b s = 9 % x s = % ằ ạ y ầ ủ O ề đ ồ ừ % – 110% .

- ể ự đ đ ồ ủ ƣơ ằ ả ủ O l % – % ả b s x s T y ầ l ự ệ ồ đ % g/ml), 120% (60 l để ế ả í x

Chương 4. BÀN UẬN 4.1. Khảo sát dung môi pha động và tỉ lệ pha động

T ả ứ y ệ ô đ đƣợ sử ụ ổ b ế í G s bằ ƣơ HPLC pha đả l CAN - H2O N ế ả s ệ dung môi ACN – H2O trên đả T l x , , Kế ả y hệ đ ACN – H2O (70:30 l ố ƣ ệ đồ ờ BT, DX ợ ẩ ạ đẹ , đố ƣơ ứ ô số sắ ý đề đạ y ầ

Tố đ ò l ú , 0.9ml ú , 0.8ml ú , 0.7ml ú đƣợ ể ợ ẩ BT, DX , ậ y ỉ ở l ú thì sự ử ả , ạ đố ờ lƣ ủ b s l 4.2 phú x s l ú , ờ phân tích ò ú , ở ố đ sự ầ ặ đ ô

ề ệ sắ ý ố ƣ đƣợ lự để đị lƣợ x s b methason ự ệ ƣ s

T l x , x P đ – ƣ 7

+ Detector: DAD

Bƣ s ệ UV T ể í μl

Tố đ ò , l ú T ờ í ú

Nồ đ ẩ l l 4.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Từ ế ả ự ệ , y xử lý ử đƣợ x y ự ƣ s

H 4.1 Sơ đồ y xử lý ự ệ Q ự ệ y :

- L ạ ạ bằ ƣ ể l ạ ầ ế ạ ự , l ề ở sạ

- Dị ế ắ ả lậ ô ò ạ ạ ờ lƣ ủ b s x s

- Dị ế ử ả lậ ồ đ lệ ệ í đỉ s ệ í đỉ ủ ẩ ồ đ lầ lƣợ đố b s

>9 % x s > % ằ ạ y ầ ủ O ề đ ồ ừ % – 110%.

H 4.2 Sắ ý đồ ị ế M ắ ả lậ ƣ l ạ ạ , b M ắ ả lậ đã l ạ ạ , (c) M ử ả lậ đã l ạ ạ , H ợ ẩ 4.3. Thẩm định quy trình định lƣợng

4.3.1. í tươ t í t

Tí í ợ ủ ệ ố đƣợ x đị ự đ lệ ẩ ƣơ đố RSD ủ ệ í ờ lƣ ủ x s b s sắ ý lầ l ế ị ợ ẩ x s b s ồ đ 100 l ử ả lậ ồ đ 500 àg/ml.

 Mẫu uẩ ỗ ợ Bet et so v Dex et so et t

Nhận xét: Kết quả cho th y:

- RSD% của thông số thờ lƣ % 7% % - RSD% của diệ í đỉ % 79% %

- Hệ số b đố  TB = 7 - ả Rs > TB = 9 9

- Số đ lý yế N > TB = 7 Kết luậ Q y đạ í ƣơ í ệ thố ẩ

H 4.3 Sắ ý đồ ợ ẩ s lầ

 Mẫu t ả l t ỗ ợ Bet et so v Dex et so acetat

Nhận xét: Từ bảng kết quả cho th y:

- RSD% của thông số thờ lƣ % % % - RSD% của diệ í đỉ % 97%

- Hệ số b đố  TB = 7 99 - ả Rs > TB =

- Số đ lý yế N > TB = 7

Kết luậ Q y đạ í ƣơ í ệ thố ử ả lậ

H 4.4 Sắ ý đồ ử ả lậ s lầ

4.3.2. í đặ u

Kế ả ự ệ y sắ ý đồ ủ ô đ , ắ ả lậ ô x ệ ế ƣơ ứ ế í sắ ý đồ ủ ẩ ử ả lậ ả lậ ẩ

Sắ ý đồ ủ ử ả lậ ế í ạ , ờ lƣ ế í sắ ý đồ ủ ẩ D đ , ƣơ í đặ ệ đả bả để ệ x s b s ề đƣợ ả s

4.3.3. í tuyế tí

- T ả ồ đ g/ml - 125g/ml ệ í ồ đ ủ betamethason x s ụ yế í ệ số ƣơ quan R2 lầ lƣợt l 9999 betamethason) v 1 (dexamethasone acetat).

- P ƣơ ồ y ủ betamethason đƣợ b ể ễ l : y = 202855x + 270103, R2 = 0.9999

- P ƣơ ồ y ủ x s đƣợ b ể ễ l y = 189884x + 418329, R2 = 1

Sử ụ s F T để ể y ƣơ yế í ủ b s x s í ƣơ í , ệ số ệ số b ủ ƣơ đề ý

4.3.4. át LOD v đị lượ LOQ

Dự đ lệch chuẩn củ đ ứng (S E đ dốc ủ đườ ẩ . Gi i hạn phát hiệ LOD ạ đị lƣợ LOQ ủ betamethason dexamethasone acetat tính đƣợ ƣ s

 Betamethason

 Dexamethasone acetate

;

Tuy nhiên, ệ x đị LOD, LOQ sử ụ ị l ã

ồ đ ả ầ , để x đị đ ứ ủ ế bị ƣờ đƣợ yế í

3.3.5. chính xác trong y

Q ự ệ y: P ƣơ đ í x O , đ lệ ẩ ƣơ đố RSD ủ ệ í Bethamethasone Dexamethasone acetate ị ô 7.3% ( % 1.03%).

4.3.6. t u ồ

- Lƣợ í y ầ ử đ í x cao, betamethasone = 90.36% x s = 86.14% ằ ạ y ầ ủ O ề đ ồ ừ % – 110% . C ể ự đ đ ồ ủ ƣơ ằ ả ủ O l 80% – 110% ả betamethasone dexamethasone acetat T y ầ l ự ệ ồ đ % g/ml), 120% (60 l để ế ả í x

52 K T UẬN

Q ự ệ đã đƣợ ế ả đ ứ đƣợ ụ nghiên ứ

- X y ự đƣợ đị í đị lƣợ đồ ờ b s , x s bằ ƣơ sắ ý lỏ ệ ă cao đầ ò DAD.

- T ẩ đị đị í , đị lƣợ đồ ờ b s , x s bằ ƣơ sắ ý lỏ ệ ă cao đầ ò DAD đạ ƣ ủ O

- T y , ờ ạ số ỉ ò ƣ ệ , ò í s y đ , ầ ự ệ để ỉ ƣơ ể ứ ụ để í ự ế

TÀI IỆU THAM KHẢO

1. N yễ ứ T , X đị số s ự ẩ ứ ă bằ HPL , ạ Dƣợ H N

2. T ầ T ị D ệ O , N ô Vă T y , Tô M H , “X y ự ẩ đị ƣơ sắ ý lỏ ệ ă í đồ ờ ế ẩ ừ ƣợ l ệ ”, T í Y ọ quâ sự, Số 3. T ầ N L ậ , N ứ x y ự í số

l ụy ạ ế ẩ đô ƣợ đ ề ị bằ ƣơ sắ ý lỏ s ệ ă đầ ò U -Vis, L ậ ă y , ạ Y ƣợ ầ T ơ

4. T ị T ị Q y, Sơ , “N ứ ệ số l ố đô ƣợ bằ ƣơ HPL ”, Tạ í K ể T ố , Tậ số , -17.

5. AOAC International (2016), Guidelines for Standard Method Performance Requirements, AOAC Official Methods of Analysis, pp. 1-18.

PHỤ ỤC

PHỤ LỤ DỮ LIỆU KIỂM TR TÍNH TƯƠNG THÍ H HỆ THỐNG

H PL Sắ ý đồ ể í TTHT ợ ẩ

H PL Sắ ý đồ ể í TTHT ử ả lậ

PHỤ LỤ DỮ LIỆU KIỂM TR TÍNH TUYẾN TÍNH

H PL Sắ ý đồ ể í yế í 1

Hình PL 2.2. Sắ ý đồ ể í yế í 2

PHỤ LỤ KẾT QUẢ X Y DỰNG QUY TR NH X L M U

Hình PL 3.1 Sắ ý đồ ả s ô ế

H PL Sắ ý đồ ả s y l ạ ạ

Hình PL 3.3 Sắ ý đồ l ạ ạp

Hình PL 3.4 Sắ ý đồ ắ ả lậ đã l ạ ạ

Hình PL 3.6 Sắ ý đồ ử ả lậ đã l ạ ạ PHỤ LỤ 4 KẾT QUẢ HIỆU

Hình PL 4.1 Sắ ý đồ ả s đ đặ ệ