2. Thực nghiệm và kết quả
2.1.4. Khảo sát Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) trong
giá trị của cây Quéo, tăng thu nhập cho người trồng Quéo, chắc chắn sẽ giúp góp phần tích cực tạo thêm thế mạnh cho cây Quéo đứng vững trong hàng những cây ăn quả, nhất là hiện nay Xoài(Quéo) Miền Nam đang lan tràn trên thị trường Miền Bắc, làm giảm giá trị của quả Quéo Sofn La.
2.1.4. Khảo sát phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) trong định lượngMangiferin. Mangiferin.
Mẫu nguyên liệu: lá của cây Quéo Sơn La 10 năm (trước ra hoa).
Cân chính xác 0,0096g Mangiíerin chuẩn, hoà trong 80ml Methanol trong bình định mức có nút mài dung tích lOOml. Lắc đến tan hết Mangiíerin, cho thêm Methanol cho đến vạch, lắc đều.
b. Chuẩn bị dịch chiết dược liệu:
Cân chính xác khoảng 1,0000g dược liệu, đã xác định độ ẩm. Gói vào túi giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet, loại Clorophyl trong dược liệu bằng Cloroíorm cho tới khi dịch chiết không màu, bỏ dịch chiết Cloroíorm. Sau đó chiết tiếp bằng Methanol cho tới khi hết Mangiíerin. Chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 ml, tráng bình chiết 3 lần bằng Methanol. Thêm Methanol vào bình định mức tới vạch chuẩn. Lắc đều. Hút chính xác lOml dung dịch trên cho vào bình định mức lOOml, thêm Methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.
c. Tiến hành:
• Máy : máy HPLC HPllOO — Henlett packard. • Cột: RP18 (5 | L i m ) , 4,6 X 20mm. • Pha động: Methanol. • P h a tĩnh: R P 1 8 . • Detector: tử ngoại. • Bước sóng phát hiện: 369nm. • Tốc độ dòng: Iml/phút. • Tốc độ giấy: 2,5mm/phút.
+ Sau đó, tiêm chính xác 2 01^1 dung dịch mẫu. + Mỗi mẫu được nhắc lại 3 lần.
Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ, được in ra giấy.
+ Trên sắc ký đồ của dung dịch Mangiíerin chuẩn có pic với thời gian lưu từ 2,5 - 3 phút đó là Mangiíerin (phụ lục I).
+ Trên sắc ký đồ của dịch chiết cũng có pic với thời gian lưu từ 2,5 -3 phút đó là Mangiferin trong dịch chiết (phụ lục II).
+ Đo diện tích của các pic mẫu chuẩn và các pic mẫu dược liệu tính trung bình. Kết quả : = 1427,26359 ; =3361,92399
Hàm lượng Mangiferin được tính theo công thức sau:
S^C,k. 100.100
x%\ hàm lượng % Mangiíerin trong lá cây Quéo Sơn La.
: diện tích trung bình của các pic của dung dịch mẫu dược liệu.
Ỵ : diện tích trung bình của các pic của dung dịch mẫu chuẩn,
k: độ pha loãng.
Q : Nồng độ % (g/lOOml) của dung dịch chuẩn.
ĩĩIdl: khối lượng dược liệu, h: độ ẩm dược liệu.
_ 1427,26359x 0,0096x IQ x lOOx 100 _ ^ 3361,92399x1,0066x90,97 “ ’
*Nhận xét: Định lượng Mangiíerin trong lá cây Quéo 10 năm tuổi bằng phương pháp SKLCA, tính được hàm lượng Mangiíerin là 4,45% thấp hơn so với hàm lượng Mangiíerin trong phương pháp đo quang là 4,51%. Sự sai số giữa hai phương pháp không có ý nghĩa. Chính vì vậy, chúng tôi chỉ khảo sát định lượng Mangiíerin trong một mẫu dược liệu, để thử nghiệm một phương
pháp mới và để kiểm tra độ chính xác của phương pháp đo quang.
2.2. Tiếp tục nghiên cứu, phân lập thành phần hoá học trong lá cây Quéo Sơn La.
Đề tài “Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học trong cây Quéo Sơn La ” Dược sĩ Lê Thị Thuý đã chiết xuất và p h ân lập được Mangiíerin .
Trong khi nghiên cứu chúng tôi đã phát hiện được chất kết tinh là chất c . Do vậy, chúng tôi tiến hành phân lập chất c theo qui trình sau
2.2.1 Qui trình phân lập chất c .
Cân 500,OOg lá Quéo Sơn La, chiết Soxhlet với cloroíorm trong 20*’. Cất thu hồi dung môi được cắn A. Thêm 50ml cồn 96°, hoà tan cắn và cho thêm 2 thìa than hoạt, đun cách thuỷ 15’. Lọc nóng, dịch lọc cho vào cốc có mỏ. Để bay hơi ở nhiệt độ phòng. Sau 2 ngày, có kết tinh trong cốc. Ly tâm lấy tinh thể. Kết tinh lại nhiều lần. Thu được chất c kiểm tra bằng sắc ký lại với nhiều hệ dung môi thấy chất c tinh khiết. Lấy một ít tinh thể cho lên trên mảnh thuỷ tinh vỡ, đốt trên đèn cồn thấy tinh thể là chất hữu cơ. Xem tinh thể ở ảnh 4.
*Kiểm tra độ tinh khiết: chấm sắc ký lớp mỏng dung dịch chất c trong cloroform ở các hệ dung môi:
CHCI3 : Etyl Acetat nHexan: Methanol
CHCI3 : Methanol
[9:1] [4:1] [19:1]
Trên sắc ký đồ SKLM ở 3 hệ dung môi dung dịch chất c là một vết tương tự
như vết thứ 4 trong sắc ký đồ SKLM của dịch lọc B (hình 2). Kết quả được thể hiện ở bảng 18, hình 2, ảnh 5. • • 0 0 r \ 0 --- • — • --- B c CHCI3:EA • • 0 0 0 ---• • --- B c [9:1] nHexan;MeOH [4:1] CHCL:MeOH [19:1]
Bảng 20: Kết quả sắc ký chất c trong cây Quéo Sơn La.
STT Hệ dung môi Màu sắc Rf
254nm 366nm I2
1 CHClgiEA [9:1] Nâu Xanh lơ Vàng 0,75
2 NHexan:MeOH [4:1] Nâu Xanh lơ Vàng 0,79
3 CHCl3:MeOH[19:l] Nâu Xanh lơ Vàng 0,72
2.2.2 Sơ bộ nhận dạng chất C:
• Chất c tan tốt trong cloroform, aceton, tan trong cồn 90°, metanol nóng, không tan trong nước.
• Điểm chảy: t° của chất C: 2 1 0 -2 1 1 °c
• Phổ tử ngoại của chất c trong cloroform cho đỉnh hấp thụ
= 2 8 1 n m (P hụ lụ cIII).
• Phổ khối cho pic phân tử M ^ = 426 tương ứng với công thức cấu tạo là Qo^soO.
+ Phổ khối cho các mảnh có số khối là: m/e 426; m/e 302; m/e 204; m/e 189; m/e 147 trong đó pic có số là 204 có tần số 100%.
+ So với thư viện phổ Willey 275.L thì chất c có độ trùng lặp là 94% với chất Alnulin.
- s L
♦
%
M. Jằđ
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 1. KẾT LUẬN.
Sau một thời gian nghiên cứu về cây Quéo Sơn La chúng tôi đã thu được kết quả như sau:
* Mangiferin được tích lũy trong cả 3 bộ phận vỏ rễ, vỏ thân, lá của cây. + Ngay từ khi 1 tuổi hàm lượng trong 3 bộ phận đã khá cao trong vỏ rễ là 4,96%, vỏ thân - 4,48%, lá - 3,93%.
+ Vỏ rễ của cây 10 tuổi có hàm lượng Mangiferin là 6,52%, vỏ thân- 6,10%, l á -4,51% .
+ Hàm lượng Mangiferin trong lá non của cây 10 tuổi là 4,67%, lá bánh tẻ - 4,49%, lá già - 4,25%, lá sắp rụng - 0,77%. Hàm lượng Mangiferin trong lá
non là cao nhất, thấp nhất ở lá già sắp rụng.
* Đã nghiên cứu sự biến động hàm lượng Mangiferin trong quá trình sinh trưcmg trong lá cây,
+ Hàm lượng Mangiferin trong lá tăng theo vói tuổi của cây:
Cây 1 tuổi có hàm lượng Mangiferin là 3,93%, 2 tuổi - 4,00%, 5 tuổi -
4,21%, 7 tuổi - 4,31%, 10 tuổi - 4,51%, nhiều tuổi - 4,80%. Trong những năm khảo sát, cây 10 tuổi hàm lượng Mangiferin là cao nhất.
* Đã nghiên cứu sự biến động hàm lượng Mangiferin trong từng thời kỳ phát triển của lá cây.
Hàm lượng Mangiferin của lá Quéo sau khi ra hoa là 4,60%, trước khi ra hoa - 4,51% và trong khi ra hoa - 4,24%.
* Đã khảo sát và so sánh phương pháp định lượng Mangiíerin bằng HPLC và phương pháp đo quang nhận thấy 2 phương pháp cho kết quả tương đương nhau.
* Đã phân lập được trong lá Quéo Sơn La 1 chất c, cho biết chất c chiết được có nhiệt độ nóng chảy 210 -ỉ- 2i r c , phổ u v cho đỉnh hấp thụ 281nm,
phổ khối cho biết khối lượng phân tử M=426, so với thư viện phổ tương ứng với chất Alnulin. Độ trùng lặp là 94%.
2. Đề xuất.
Nghiên cứu sự tích luỹ, biến động hàm lượng Mangiferin trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Quéo Sơn La là một đề tài rộng, trong một thời gian ngắn chúng tôi chỉ có thể kết luận sơ bộ và tương đối. Để công trình này thật sự có thể áp dụng vào thực tế, cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu nhằm giúp việc khai thác nguyên liệu sản xuất Mangiíerin có hiệu quả, làm tăng thêm giá trị cây Quéo Sơn La, tăng thu nhập cho người trồng. Chắc chắn sẽ góp phần tích cực tạo thêm thế mạnh cho cây Quéo đứng vững trong hàng những cây ăn quả. Chú trọng nghiên cứu sự tích luỹ biến động, hàm lượng Mangiíerin trong quá trình sinh trưởng và phát triển của những cây Quéo trên
10 tuổi, là những cây có tiềm năng khai thác sản xuất Mangferin lớn. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc của chất c và ứng dụng trong y học.
Injection Date Sample Name Acq. Operator Method Last changed 16/05/2002 11;24;45 AM Chi van c : \HPCHEM\ 1 \ỈCỈTHODS\DEF_LC. M 16/05/2002 10:38:32 AM by van
(modified after loading) Dinh luong Mangiferin
DAD1 A. Sig*đitt,4 (V mAU ị i 200 I I 150 1001 50 Ũ ...
Area Percent Report
sssssssssssss'SssssssaBnsBsiiamsisisKKaEaBSBaisssaBss
Sorted By ; Signal
Multiplier ; 1.0000
Dilution : 1.0000
Signal 1: DADl A, Sig-369,4 Ref-off
Peak RetTirae Type Width Area Height
# [min] [mini [mAU*s] EmAUj
Area
%
1 2.557 BB 0,1913 3363.02051 266.43954 100.0000
Totals : 3363.02051 266.43954
Results obtained with enhanced integrator! *** End of Report ***
Injection Date Sample Name A c q . Operator Method Last changed 16/05/2002 11:29:32 AM Ch2 ‘ Vial : 1 van c :\HPCHEM\1\METH0DS\DEF_LC.M 16/05/2002 10:38:32 AM by van
(modxfied after loading) Dinh luong Mangiferin
d ã d ĩ ã; m A U i s 200 150 100- T'. JL jsid Sorted By Multiplier Dilution
Signal 1; DADl A, Sig=369/4 Ref»off
Peak RetTime Type Width Area
# [min] tmin] [mAU*s]
Area Percent Report Signal 1.0000 1.0000 Height [mAU] Area % 1 2.556 BB 0.1912 3366.87354 266.87091 100.0000 Totals : 33$6.87354 266.87091
Results obtained with enhanced integrator! *** End of Report ***
Sample Name: Ch3 Injection Date Sample Name Acq, Operator Method Last changed 16/05/2002 11:34:38 AM Ch3 van C ; \HPCHEM\ 1 \METHODS\DEF_IjC . M 16/05/2002 10:38:32 AM by van
(modified after loading) Dinh luong Mangiferin
DA01A.Sig>369.4R«r>off(V| Vial : mAU 200- 160-i 100^ 50- jm Area”Percent*Report” Sorted By Signal Multiplier • 1.0000 Dilution • ♦ 1.0000 Signal 1: DADl A, Sig-369,4 Ref»off
Peak RetTime Type Width Area Height [mAU]
Area % # [min] [min] [ttiAU*s]
I . . . I - - - 1
1 2.557 BB 0.1912 3355.87793 265.98300 100.0000 Totals : 3355.87793 265.98300
Results obtained with enhanced integrator!
= =s==ssssssx;s = ==== = =:==ssssssss;ss:s = = =:s3SSSS8'3SsaiaiSSSs = 3cssssESSBSS == = == = =: == = =12:===;=;=;: *** End of Report ***
: 16/05/2002 11:09:48 AM
; 2
ỉ van
; c :\HPCHEM\l\METHODS\DEF_LC.M : 16/05/2002 10:38:32 AM by van
(modified after loading) Dinh luong Mangỉíerỉn
TSÃBĩxsig^ãTRaEõrõn Injection Date Sample Name Acq, Operator Method Last changed Vial : 1 0 ĩ ’ ó 2 !__ JÉ3
Area Percent Report
Sorted By : Signal
Multiplier ; 1.0000
Dilution : 1.0000
Signal 1: DADl A , Sig-369,4 Ref-off
Peak RetTime Type Width Area
# [man] [mini tmAU*s]
1 i . • i Height [mAU] Area % I 1 2,555 BB 0.2032 1426.61731 107.21069 100.0000 Totals J 1426.61731 107.21069
Results obtained with enhanced integrator!
* * * End of Report ***
ie /0 5 /2 0 0 2 1 1 :1 4 :2 5 AM 3
van
c ;\HPCHEM\1\METH0DS\DEF L C .M 16/05/2002 10;38¡32 AM by van
(modified after loading) Dinh luong Mangiferin
Injection Date Sample Name Acq. Operator Method
Laat changed
Area Percent Report
Sorted By ; Signal
Multiplier : l.GOOO
Dilution i 1.0000
Signal 1: DADl A, Sig=369,4 Ref=off
Peak RetTime Type Width Area
# [min] [min] . (mAU*s}
Height [mAU] Area % Ỉ I 1 2.555 BB 0.2032 1426.33716 107.20525 100.0000 Totals ; 1426.33716 107.20525
Results obtained with enhanced integrator! *** End of Report ***
Injection Date Sample Name Acq. Operator Method Last changed 16/05/2002 Xia9:08 AM 1 Vial : van c :\HPCHEM\1\METH0DS\DEF_LC.M 16/05/2002 10:38;32 AM by van
{modified after loading) Dinh lụong Mangiferin
OAD1A,S)o<^,4Raf>OffC/
Sorted By Multiplier Dilution
Signal 1: DADl A, Sig«369,4 Ref»o£f
Peak RetTiine Type Width Area
# irain] Imin] [mAU*s]
Signal 1.0000 1.0000 Height tiriAU] Area % ' 1' 2.55S BB 0.2011 1428.83630 '107.45Ể77 100.0000 Totals : 1428.83630 107,45677
Results obtained with enhanced integrator!
s a S£ s s s s - a e t s s s s 8S 'S Í s s «S s s s s s «S s a s S: a e s s a s s 'S
*** Ehd of Report ***
Gain ABS____________ tTie Taggna File 1 OJWffiHTt
13 Hay 2B82
122 SBU 2.B
OFF Page 3__________
T i m A V DATA
ABS : B.eoBB -> i,saee ilH 198 ,0 0 -> 8 0 0 . ^
BaseJiiie Erase View Re-scaJe Zoom Cursor LabeJ More
Perform baseline collect
Library Searched : C:\DATABASB\WII^Y275 L Quality j 94 D - F r i e d o o l e a n - 1 4 - e n - 3 - o l , ( 3 . b e t a ) - fCAS) __________________ « prUdooi«;,. ndance ^ ... —--- S c a n 1 2 1 ( 4 . 0 5 2 m i n ) : N - D I P 7 4 0 . D ( * T - 1 i*<|i|*,“ i 4 i t i n 4 T ‘n T f ^ .4 ' f i'M 2(l4 8 0 0 0 - 6 0 0 0 4 0 0 0 ^ 2000 - 69 95 ■n^ 50 ^?!49 100 1 8 9 302 2 6 9 ISO 2 00 2 5 0 4 2 5 4 1 1 3 0 0 f: ’ ■ ■ l‘“" 3 S 0 4 0 0 JL
TÀI LIỆU THAM KHẢO /
1. Bộ môn Dược Liệu, trưòrng đại học Dược Hà Nội-Bài giảtíg dược liệu tập
I, 1998. ^
2. Bộ môn Dược liệu, trưòrng đại học Dược Hà Nội-Thực tập dược liệu (phần hoá học), 1999.
3. Bộ môn Hoá phân tích, trưòỉng đại học Dược Hà Nội-Hoá phân tích II,
1998.
4. Bùi Thị Bằng - Định lượng Mangiferin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp - Tạp chí Dược học số 5/1991 - Trang 28, 29.
5. Vũ Văn Chuyên-Thực vật học, NXB Y học, 1971, tập II, trang 63
6. Vũ Văn Chuyên-Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc, NXB Y học, 1976, trang 11.
7. Nguyễn Vãn Đàn, Nguyễn Việt Tựu-Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, NXB Y học, 1985.
8. Phạm Hoàng Hộ-Cây cỏ Việt Nam, Quyển II, tập 1, Montreal, 1992, trang 458, 460.
9. Trần Hợp Phân loại thực vật, NXB đại học và trung học chuyên nghiệp, 1968, trang 139.
10. Lê Khả Kế- Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, NXB Khoa Học-1999,
trangS 1.
11. Đỗ Tất Lợi-Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học - 1999, trang 569.
12. Phạm Xuân Sinh, Phạm Gia Khôi-Nghiên cứu chiết xuất và xác định flavonoid Mangiferin trong vỏ và lá cây Xoài - Tạp chí dược học số 5/1991 trang 8,19.
13. Bế Thị Thuấn - Flavonoid và một số tác dụng sinh học của chúng - Tài liệu sau đại học trường ĐHDHN, trang 6.
15. Lê Thị Thúy-Luận văn tốt nghiệp “Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học của cây Quéo Sơn La” - 2001
16. Nguyễn Thị Thủy - Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và tích lũy tinh dầu
của hai giống Bạc Hà TN-8 và TN -26 có hàm lượng M entol cao (Luận án PTS khoa học Sinh học), trang 64-91.