CH NG I : T NG QUAN
6. K TH UT NGHIÊN CU
6.1. Ph ng pháp kh o sát tr c ti p (nhu m Gram) [18, 12]
LƠăph ngăphápănhu măthôngăth ng nh t trong các phịng thí nghi m vi
sinh.ăPh ngăphápănƠyăchoăphépăxácăđnh hình d ng, cách s p x p, và phân bi t
đ c vi khu n là thu c lo i Gram (+) hay Gram (-).
Nguyên t c: Do s khác bi t v c u trúc vách t bào nên trong quá trình nhu m gram, vi khu nă gramă d ngă s gi đ c ph c h p tím Gentians-iod khơng b t y màu b i c n, trong khi vi khu n gram âm không gi đ c ph c h p màu này, do v y k t qu sau khi nhu m là vi khu năgramăd ngăv n gi
đ c màu tím c a gentian, cịn vi khu năgramăơmă nămƠuăh ng c a ph m màu Safranin hay Fuchsin[15].
Quy trình nhu m Gram
B c 1: L y khu n l c nghi ng là S. aureus trênăđ aăth ch.
B c 2: Dàn tiêu b n - ánhăs tiêu b n - Dàn b nh ph m lên lam kính. - t tiêu b nălênăgiáăđ . - C đnh tiêu b n. B c 3: K thu t nhu m: - tălameălênăgiáăđ .
- Ph đ y tím Crystal violet kh p b m tălameă(đ kho ng 0,5-1 phút). - R a n c.
- Ph đ y dung d chăGramsăiodineă(Lugol)ă(đ kho ng 30 giây). - T y màu b ng dung d ch Methanol.
- R aăn c.
- Ph đ y Safranin ho căFuschină(đ kho ng 30 giây). - R aăn c.
B că5:ă c k t qu
Nh m t gi t d uăsoi,ăđ t lên kính hi n vi soi v t kính x100. Khi tr l i m t k t qu nhu m gram, ph i tr l i các chi ti t:
- Hình dáng vi khu n.
- Cách s p x p các vi khu n.
- Cáchă nămƠuăc a vi khu n (vi khu n Gram [+] hay Gram [-]).
6.2. Ph ng pháp c y phân l p [11, 12]
6.2.1. Nguyên t c
Dùngăph ngăphápăc y phân l păđ tách riêng t ng t bào vi sinh v t trên
mơiătr ng ni c y và có th đ măđ c s l ng khu n l c m c trên nuôi c y.
6.2.2. Cách l y b nh ph m
- Ch đnh l y m u: t t c cácătr ng h p có m , dchănh ăm abcess; v t
th ng,ăv t m nhi m trùng.
- Các m uăđ c l y theo nguyên t căđ m b o vô trùng nghiêm ng t và theo ch đnh c aăbácăs .
- Cách l y: lau s ch vùng da bên ngoài v i c n 70%. Dùng t m bông vô trùng th măn c mu i sinh lý vô trùng qu t l y m , d ch cho vào tube vô trùng r iăđemă
v phịng thí nghi m c y ngay.
Hình 2. 3. M , d ch trên abcess.
6.2.3. X lý b nh ph m, nuôi c y và phân l p.
- B nh ph m sau khiăđemăv khoa s đ căđemăquanăsátăđ i th trong t c y vô trùng: máu hay m ; m nh y hay khô; màu vàng hay tr ng xanh. - N u b nh ph măkhô:ăt ngăsinhătrongămôiătr ngăBHIătr c khi nuôi c y. - N u b nh ph m nh yă t, th c hi n theo quy trình sau:
S ăđ 2. 1. Quy trình ni c y, phân l păvƠăđnh danh S. aureus
B nh ph m
Nuôi c y trên BA, Uri Select 4 20-24 gi
37oC
Ch n khu n l c thích h p
Nhu m Gram Th nghi m sinh hóa (catalase, coagulase,
chapman)
nh danh
6.2.4. nh danh
- Trênămôiătr ngăUriăSelectă4:ăkhu năl căS. aureus r i,ăto, trịn đ u, nh nă
bóng, mƠuăt ăvƠngănh tăđ năvƠng.
Hình 2. 4. Hình thái khu n l c S. aureus.
(Ngu n: http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus)
- Ch n khu n l c thích h păđemăquan sát qua kính hi n vi, v t kính d u
x100: b t màu Gram (+), có th b t màu Gram (-) khi l a c y quá già; hình c u, t l i m tăđámănh ăchùmănho.
- Trênămôiătr ngăBA:ătanăhuy tă .
Hình 2. 6. Kh n ngătanăhuy t c a S. aureus trênămôiătr ng BA
(Ngu n:http://www.bacteriainphotos.com/agar%20cultivation%20media.html#)
- Trên mơi tr ngăChapman:ămơiătr ngăchuy năt ăđ ăsangăvƠng.
Hình 2. 7. S. aureus trênămôiătr ng Chapman. (Ngu n: http://www.geniebio.ac-aix-
- Các ph nă ngăsinhăhóa:ăcatalase (+),coagulase (+).
Hình 2. 8. Ph n ng coagulase
(Ngu n: http://www.cram.com/flashcards/microbiology-final-lab-
practical-biochemcial-tests-1994292 )
Hình 2. 9. Ph n ng catalase
(Ngu n: Hình nh c a Dr. Lesley McGee, CDC)
(+)
7. Kháng sinh đ theo ph ng pháp Kirby-Bauer.
7.1. Nguyên t c[11, 18, 22]:
Khángă sinhă t mă vƠoă đ aă gi yă v iă n ngă đ ă thíchă h pă s ă khu chă tánă raă m tă th chăxungăquanhăvƠăng năch năs ăphátătri năc aăviăkhu n.ă ngăkínhăvịngăvơ
khu năb ă căch ăth ăhi nătínhănh yăc măc aăviăkhu năđ iăv iăthu căkhángăsinh.ă Tr ngă h pă khơngă cóă vịngă că ch ă cóăngh aă lƠă viă khu nă khángă l iă thu căkhángă
sinh.
Ph ngă phápă nƠyă đ că ắU ă bană Qu că giaă v ă cácă chu nă m că phịngă thíă nghi mălơmăsƠng (NCCLS)”ch pthu năvƠăbi nălu nătheoăNCCLS.
7.2. V t li u ậ Ph ng pháp[18, 22]
7.2.1. a kháng sinh
LƠănh ngăđ aăgi yăcóăđ ngăkínhă6mmăđ căt măm tădungăd chăthu căkhángă sinhăv iăn ngăđ ătiêuăchu n.ă aăkhángăsinhăph iăđ căb oăqu nătrongăcácă ngăcóă ch aăch tăch ngă mă ănhi tăđ ăd iă4oC.ăKhiăchu năb ădùngăthìăl yăraăvƠăđ ă ănhi tă đ ăphòngăt ă1-βăgi .
Tiêuăchu năl aăch năkhángăsinhăth ănghi măth căhi nătheoăh ngăd năchiăti tă c aăU ăBanăQu căGiaăăv ătiêuăchu năc aăcácăphịngăthíănghi măt iăM ă(NCCLS).
Các tiêuăchu năl aăch năkháng sinh:
Ch năkhángăsinhăđ iădi năchoănhómăcóăcùngăph ăho tăđ ng.
Tùyăthu căvƠoălo iăviăkhu năth ănghi m.
Tùyăthu căvƠoăv ătríănhi măkhu n.
Tùyătheoăchi năl căvƠăchínhăsáchăs ăd ngăkhángăsinhă ăt ngăvùng,ăt ngă đ aăph ng.
7.2.2. Môi tr ng
Môiătr ngăch năl cădùngăđ ăth ănghi măkhu chătánătrongăth chătrênăcácăviă khu năth ngălƠămôiătr ngăMHA. H păth chăkhángăsinhăđ ăcóăđ ădƠyă4mmăvƠăcóă
pHăt ă7,β-7,4.ăMơiătr ngăđ căb oăqu nătrongăt ăl nh,ătr căkhiădùngăph iăl yăraă kh iăt ăl nhăvà đ ăđ năkhiăđ tănhi tăđ ăphòng.
7.2.3. Chu n b huy n d ch vi khu n
Trênăm tăth chăphơnăl p,ăch năkhúmăviăkhu năđi năhình,ădùngăqueăc yăvịngă l yăkhúmăviăkhu năđóăphaăvƠoăn cămu iăsinhălỦ.ă oăđ ăđ căc aăhuy năphùăđ nă khiăđ tăđ ăđ căchu nă0,3-0,5ăMc.ăFarland.ăHuy năd chăviăkhu nănh ăv yăcóăch aă kho ngă1-2x108 CFU/ml.
7.2.4. Các b c ti n hành
- Dùngăm tăt măbôngăvôătrùngănhúngăvƠoăhuy năd chăr iăl yălênăépănh ă vƠă xoayă nh ă queă gònă trênă thƠnhă ngă nghi mă đ ă lo iă b ă l ngă huy nă d chăviăkhu năth aăkh iăqueăgòn.
- Tr iăđ uăviăkhu n t ăqueăgịnălênm tăth chăMHA. ăkhơăb ăm tăth chă tr căkhiăđ tăđ aăkhángăsinh.
- tăđ aăkhángăsinhălênăm tăth chăđưătr iăviăkhu n.
- tăh păth chăđưătr iăviăkhu năvƠăđ tăđ aăkhángăsinhăvƠoăt ă mă ăγ7oC. - căvƠăbi nălu năk tăqu :
Sauăkhiă ăβ0-β4ăgi ,ăviăkhu năs ăm căthƠnhănh ngăkhúmăm năti păh pă nhauăvƠăvịngăvơăkhu nălƠăm tăvịngătrịnăđ ngănh t.
oăđ ngăkínhăvịngăvơăkhu năb ngăth căcóăđ năv ămilimet.
Tên kháng sinh Vi tăt t N ngăđ ă(µg) ngăkínhăvịngăvơăkhu n (mm) S I R Cefalexin CN 30 15-17 Cefotaxim CTX 30 15-22 Ciprofloxacin CIP 5 16-20 Vancomycin VA 30 10-11 Oxacillin OX 1 11-12 Erythromycin E 5 14-22 Gentamycin GM 10 13-14 Amikacin AN 30 15-16
B ng 2. 1. Chu năm căbi nălu năđ ngăkínhăvịngăvơăkhu năc aăS. aureus
CH NG III: K T QU
1. Kh o sát tình tr ng gơy b nh c a Staphylococcus aureus
1.1. M t s hình nh thu nh n đ c
1.1.1. L y m u
Hình 3. 1. M d ch trên v tăth ngăho i t . 1.1.2. Ni c y, phân l p
Hình 3. 3. Kh n ngătiêuăhuy t c a S. aureus trênămơiătr ng BA 1.1.3. Nhu m Gram
Hình 3. 4. Hình thái vi khu n S. aureus d i kính hi n vi, v t kính x100 1.1.4. M t s th nghi m sinh hóa 1.1.4. M t s th nghi m sinh hóa
Hình 3.5. Ph n ng catalase (-) (+)
Hình 3. 5. Ph n ng coagulase
1.1.5. Kháng sinh đ
Hình 3. 7. Khángăsinhăđ ăS. aureus
1.2. C c u vi khu n phơn l p đ c t m u b nh ph m trên v t th ng, v t m
Trongăt ngăs ă1.237 m uăb nhăph măm ,ăd chătrênăv tăth ng,ăv tăm ăđ că kh oăsátăt iăKhoaăviăsinhăv t-B nhăvi nă175ătrongăth iăgianăt ăthángă07/β01γăđ nă
tháng 04/2014 thì có 640 m uăchoăk tăqu ănhi măkhu năchung,ătrongăđóăcóăγ5ăm uă d ngătínhăv iăStaphylococcus aureus.ăK tăqu ăc ăth ănh ăsau:
B ng 3. 1. T l các loài vi khu n phân l păđ c trên v tăth ng,ăv t m
Tên viăkhu n n T ăl ă%
Pseudomonas aeruginosa 24 3.75% Moraxella catarrhalis 34 5.31% Staphylococcus aureus 35 5.47% Streptococcus agalactiae 39 6.09% Escherichia coli 68 10.63% Acinetobacter.sp 70 10.94% Enterococcus feacalis 94 14.69% Klepsiella pneumoniae 103 16.09% Viăkhu năkhác 30 4.69% T ng 640 100.00%
Bi uăđ 1. 1. T l các loài vi khu n phân l păđ c trên v t m , v tăth ng.
0.00% 5.00% 10.00% 15.00% 20.00% 25.00%
Nh n xét: Các vi khu năth ng g p trên v tăth ngăv t m là Staphylococcus epidermidis (22,34%), Klebsiella pneumoniae (16,09%), Enterococcus faecalis (14,69%), Acinetobacter.sp (10,94%), E. coli (10,63%), Streptococcus agalactiae (6,09%), Moraxella catarrhalis (5,31%) và Staphylococcus aureus (5,47%). Bi u
đ cho th y t l nhi m S. aureus th păh năm t s loài vi khu n khác, tuy nhiên nó
c ngăđóngăvaiătrịăr t quan tr ng trong nhi m khu n v tăth ng,ăv t m .
1.3. T l nhi m khu n theo lo i b nh lý
B ng 3. 2. T l nhi m khu n S. aureus theo lo i b nh lý
Lo iănhi m khu n S ăl ng T ăl ă% p
V tăth ng 29/487 7.11%
>0,05
V tăm 4/170 2.35%
Khác 2/62 3.23%
T ng 35/640 5.47%
Bi uăđ 1. 2. T l nhi m khu n S. aureus theo b nh lý
56.03% 18.55%
25.43%
Nh n xét: Theo k t qu th ng kê t b ng 3.2 cho th y khơng có s khác bi t
cóăỦăngh aăth ng kê v i (p=0,565) gi a nhi m khu n t c u vàng v tăth ng,ăv t m và m t s lo i t năth ngăkhác; doăkhiăđưăb th ng thì các v tăth ng,ăv t m b h hay v t b ng ho c m t s t năth ngăkhácăt c uăđ u có kh n ngăd dàng xâm nh p vào và gây nhi mătrùngăđ c.
1.4. V gi i tính và nhóm tu i
B ng 3. 3. T l nhi m khu n S. aureus theo tu i và gi i tính Gi i tính Tu i Nam N p n T l % n T l % >0,05 <20 tu i 3/72 4.17% 0/5 0.00% 20-60 tu i 23/376 6.12% 6/127 4.72% >60 tu i 2/39 5.13% 1/21 4.76% T ng 28/487 5.75% 7/153 4.58%
Bi uăđ 1. 3. T l nhi m khu n S. aureus theoăđ tu i và gi i tính
Nh n xét: Qua s li u b ng 3.3 và th ng kê cho th y khơng có s khác bi t
v t l nhi m khu n S. aureus nam và n m i l a tu i (p=0.495). Nguyên 0.00% 1.00% 2.00% 3.00% 4.00% 5.00% 6.00% 7.00%
<β0ătu i 20-60ătu i >60ătu i
4.17% 6.12% 5.13% 0.00% 4.72% 4.76% Nam N
nhân có th do tr emăvƠă ng i già có h mi n d chă ch aă hoƠnă thi n, s căđ
kháng y uăh năl a tu iălaoăđ ng. Còn đ tu iălaoăđ ngăđưăcóăkh n ngăthamăgia
giaoăthơngăvƠălaoăđ ng,ădoăđóăd x y ra xây xát d năđ n b th ng,ăt c u có th d dàng xâm nh păvƠo.ăNh ăv y, kh n ngănhi m trùng do t c u vàng có th x y ra nam và n trong m i l a tu iălƠănh ănhau.
1.5. M i liên quan gi a th i gian b nh nhân n m vi n v i t l nhi m
khu n S. aureus trên v t th ng, v t m .
B ng 3. 4. M i liên quan gi a th i gian n m vi n và t l nhi m khu n S. aureus trên v tăth ng,ăv t m .
Th iăgianănh păvi n n % p ≤βăngƠy 31/473 6.55% >0.05 3-30 ngày 4/167 2.40% >30 ngày 0/0 0.00% T ng 35/640 5.47%
Bi uăđ 1. 4. M i liên quan gi a th i gian n m vi n và t l nhi m khu n S.aureus trên v tăth ng,ăv t m .
73.24% 26.76%
Nh n xét: Theo k t qu th ng kê qua b ng 3.4, v i m căỦăngh aă(p=0.553) cho th y khơng có s khác bi t gi a th i gian b nh nhân n m vi n và t l nhi m khu n S. aureus. Nguyên nhân:
- i v i b nh nhân b nhi m khu nătr c khi nh p vi n: có th do khi b
th ng,ăb nh nhân t đi u tr t i nhà, môiătr ngăđi u tr,ăb ngăg căkhơngăđ m b o v sinh,ầkhiătình tr ng nhi m trùng ngày càng n ngăh năm i nh p vi n; ho c do
môiătr ng làm vi c hay b m t gây t năth ngăđưăch a s n t c u,ădoăđó,ăkhiăb
xây xát, t c u d dàng xâm nh p và gây nhi mătrùng,ầ
- i v i b nh nhân b nhi m trùng sau m : có th do khi b nh nhân nh p vi n,ămôiătr ng và các d ng c , thi t b , hay tay nhân viên y t ,...trong b nh vi n
ch a đ m b o v sinh. ơyăc ngălƠăv năđ r t quan tr ng c năđ c quan tâm và ki m soát ch t ch . Nguyên nhân khác có th do cách l y m uăch aăđ t,ădoăch aă đ m b o nghiêm ng t v đ vô trùng trong khi l y m u; ho c do d ng c l y m u s yăch aăđ m b o s chăhoƠnătoƠn,ầd năđ n tình tr ng ngo i nhi m.
1.6. M i liên quan gi a ti n s s c kh e đ i v i t l nhi m khu n
S.aureus trên b nh nhân ngo i khoa.
B ng 3. 5. M i liên quan gi a ti n s s c kh eăđ i v i t l nhi m khu n S. aureus trên b nh nhân ngo i khoa
Ti n s s c kh e S l ng (n) T l % p Kh e m nh 29/436 6.65%
>0,05
Có ti n s b nh m n tính 6/204 2.94%
Bi uăđ 1. 5. M i liên quan gi a ti n s s c kh eăđ i v i t l nhi m khu n S.aureus trên b nh nhân ngo i khoa.
Nh n xét: Theo k t qu th ng kê b ng 3.5, cho th y khơng có s khác bi t có
Ủă ngh aă th ng kê m că Ủă ngh aă (p=0.6γ0).ă Nh ă v y, kh n ngă nhi m khu n S.aureus b nh nhân có ti n s m c b nh m n tính và b nh nhân kh e m nh bình
th ngălƠănh ănhau.ăNguyên nhân có th do b nh nhân m c b nh m n tính có h th ng mi n d ch suy gi m, s căđ kháng th p h năng iăbìnhăth ng, vì v y d dàng t oăđi u ki n cho t c u xâm nh p, phát tri n và gây b nh. Còn b nh nhân kh e m nh có th do kh n ngăthamăgiaălaoăđ ng, ho tăđ ng nhi u, d b xây xát hay tai n nălaoăđ ng, tai n n giao thông d năđ n b th ng,ănênăt c uăvƠngăc ngă
có kh n ngăxơmănh p và gây nhi m trùng.
69.34% 30.66%
2. Kh n ng đ kháng kháng sinh c a S. aureus
B ng 3. 6. T l đ kháng kháng sinh c a S. aureus
N=35 Nh y c m (S) Trung gian (I) kháng (R) Tên kháng sinh n T l % n T l % n %T l Oxacillin 0 0.00% 0 0.00% 35 100.00% Cefotaxime 1 3.03% 6 18.18% 26 78.79% Cefalexin 1 2.86% 10 28.57% 24 68.57% Erythromycin 7 18.18% 20 21.21% 33 60.61% Colistin 2 10.00% 6 30.00% 12 60.00% Gentamycin 15 42.86% 4 11.43% 16 45.71% Ciprofloxacin 16 48.48% 10 30.30% 7 21.21% Ankamicin 18 81.82% 0 0.00% 4 18.18% Vancomycin 35 100.00% 0 0.00% 0 0.00%
Bi uăđ 1. 6. T ăl ăđ ăkhángăkhángăsinhăc aăStaphylococcus aureus.
0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00% 100.00% VA GM CS CN AN CIP CTX E OX Nh yăc m Trung gian ăkháng
Nh n xét: K tăqu ăthuăđ căchoăth yăS. aureus đ ăkhángăl iăv iănhi uăkhángă sinhăv iăt ăl ăkháăcao.ăC ăth :ă100%ăđ iăv iăoxacillin; 78,79%ăđ iăv iăcefotaxim; 68,57%ă đ iă v iă cefalexin;ă 60,61%ă đ iă v iă erythromycin; 60%ă đ iă v iă colistin;
45,71%ă đ iă v iă gentamycin; β1,β1%ă đ iă v iă ciprofloxacin; 18,18%ă đ iă v iă
amikacin. S. aureus v năcònănh yăc măv iăvancomycină(0%),ăđi uănƠyăphùăh păv iă
cácănghiênăc uătrongăn c,ăvìăhi nănayăv năch aăcóăbáoăcáoănƠoătrongăn căv ăt ă c uăvƠngăđ ăkhángăvancomycin.
Bàn lu n:
Qua th ng kê cho th y:
T l nhi m khu n do Staphylococcus aureus chi m t l (5,47%) th păh nă
so v i m t s loài vi khu n khác. Tuy nhiên, kh n ngăgơyăb nh c a loài vi khu n này trên v tăth ng,ăv t m r t quan tr ng, vì chúng có th gây ra các tình tr ng nhi m trùng nghiêm tr ng,ăđ ng th i kháng l i nhi u lo i kháng sinh d năđ n khó
kh năchoăvi căđi u tr .
V t l đ kháng kháng sinh:
Vancomycin:
K t qu thuăđ c: 0%.
K t qu này phù h p v i m t s nghiên c uănh :ăTheoăk t qu nghiên c u
đaătrungătơmăc a Ph m Hùng Vân và Ph măTháiăBìnhăn măβ005,ănghiênă
c u t i B nh vi nă aăkhoaăHoƠnăM ƠăN ngăn măβ007ăvà nghiên c u t i
b nh vi n Ch R yăn măβ010ăđ uăch aăcóăghiănh n nào v tr ng h păđ
kháng vancomycin c a S. aureus. Nh ăv y, có th th y r ng vancomycin v n là kháng sinh phù h p đ đi u tr các b nh nhi m khu n do t c u
vƠngăgơyăraămƠănguyăc ăđ kháng th p.
Vancomycin là hàng rào cu iăcùngăđ ng năch n nhi m khu n do t c u nên s đ kháng c a chúng v i lo i kháng sinh là r t nguy hi m.
K t qu kh o sát: 45,71%.