2.2.3.1. Phương phỏp tỏch chiết ARN tổng số
Quả đậu tƣơng ở g iai đoan con non đƣơc đem bao quản ở tủ lạnh sõu (- 850C). Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tỏch chiết RNA tổng số từ hạt đậu tƣơng non theo h•ớng dẫn của hãng sản xuất.
Quy trình tỏch chiết ARN tổng số đƣợc thực hiện theo cỏc bƣớc sau:
- Lấy quả đậu tƣơng đó để lạnh ở -850C tỏch lõy hat và nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và trỏnh enzyme RNase cắt RNA.( Nghiờn băng cối và chày sƣ đó đƣợc vụ trựng ).
- Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phũng (15 – 300C) trong 5 phỳt.
- Bổ sung 200l Chloroform : Isoamyl (24 : 1), đảo đều ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt.
- Ly tõm 40C, 11000 v/p trong 15 phỳt.
- Hỳt 500l dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 500l Isopropanol đó đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa.
- Để ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt, ly tõm 11000 v/p trong 15 phỳt. - Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cụ̀n 70% pha trong DEPC 0,01%. - Ly tõm 11000 v/p trong 10 phỳt.
- Làm khụ RNA bằng mỏy Speed Vac trong khoảng 3 phỳt. - Pha loóng RNA trong 40l H2O đó xử lý DEPC 0,01%. - Ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phỳt để RNA tan hết.
- Lấy 5l RNA tổng số điện di kiểm tra chất lƣợng trờn gel agarose 1%.
Chỳ ý: Do RNA dễ bị RNase cắt nờn tất cả cỏc dụng cụ đều phải xử lý DEPC 0,01% và khử trựng trƣớc khi sử dụng.
2.2.3.2. Phương phỏp điện di ADN trờn gel agarose
Tạo bản gel agarose với nụ̀ng độ thớch hợp. Dung dịch đệm dựng cho điện di là TAE 1X. Tra mẫu và chạy điện di với hiệu điện thế là 100V -110V, sau đú ADN đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi dƣới đốn UV và chụp ảnh.
2.2.3.3. Phương phỏp RT-PCR
RNA tổng số đƣợc sử dụng để nhõn gen Cystatin bằng kỹ thuật RT- PCR hai bƣớc:
Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA
- Bổ sung lần lƣợt cỏc thành phần sau đõy vào ống eppendorf 0,5ml đó đƣợc xử lý DEPC 0,01% hoặc RNase:
Thành phần Thể tớch
Mụ̀i ngẫu nhiờn 1 l
Mõu RNA tổng số 5 l
Nƣớc DEPC 0,01% 6 l
- Ủ ở 650C trong 5 phỳt, sau đú đặt vào đỏ.
Buffer 5X 4 l
RibolockTM RNase inhibitor 1 l
10 mM dNTPs 2 l
RevertAidTM M-MuLV Reverse transcriptase
1 l
Tổng 20 l
- Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đú thực hiện một chu kỡ nhiệt nhƣ sau:
Bƣớc Nhiệt độ (0C) Thời gian (phỳt)
1 25 10
2 42 60
3 72 10
4 4 ∞
Bƣớc 2: Phản ứng PCR
Dƣa vao sƣ phõn tich trinh tƣ gen ma hoa tụng h ợp cystatin ở đậu tƣơng đƣơc cụng bụ trờn ngõn hang gen quục tờ , chỳng tụi đó thiết kế căp mụi cystatin gụm mụi xuụi (Cys-Soy F) và mụ̀i ngƣợc (Cys-Soy R)
Bảng 2.2. Trỡnh tự nucleotide c ặp mụ̀i nhõn gen cystatin
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide cua mụi Nhiờt đụ gắn mồi
Cys-Soy F 5'-ATGAGAGCATTAACCTCTTC-3' 580C
Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành chạy PCR với cặp mụ̀i đặc hiệu: mụ̀i xuụi (Cys-SoyF) và mụ̀i ngƣợc (Cys-SoyR) để nhõn gen cystatin ở giống đậu tƣơng Thỏi Nguyờn.
Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt PCR đƣợc trỡnh bày trong bảng 2.2 và 2.3 sau: Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tớch (l) 1 Nƣớc khử ion 31,5 2 Dung dịch đệm 10X 5 3 MgCl2 (25 mM) 5 4 dNTPs (2,5 mM) 5 5 Mụi Cys-Soy F 1 6 Mụi Cys-Soy R 1
7 Taq polymerase (5u/1l) 0,5
8 cDNA 1
Tổng 50
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR nhõn gen cystatin
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ(0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tớnh 94 3 phỳt 1
2 Biến tớnh 94 30 giõy
3 Gắn mụ̀i 58 45 giõy 30
4 Kộo dài chuỗi 72 60 giõy
5 Hoàn tất kộo dài 72 10 phỳt 1
Sản phẩm PCR đ•ợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong đờm TAE 1X. Sau đó gel đƣơc nhuụm trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣơi ỏnh sỏng đốn cực tớm .
Sản phẩm PCR đƣợc làm sạch (thụi gel) theo bộ kit QIAquick Gel Extraction và gắn vào vector tỏch dũng pTZ57R/T (Fermentas) hoặc vector pBT (Phũng Cụng nghệ Tế bào Thực vật) và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5.
2.2.3.4. Phương phỏp gắn gen vào vector tỏch dũng (Gắn sản phẩm PCR vào
vector pBT)
Hỡnh 2.1. Sơ đụ̀ cõu truc vector pBT
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tỏch dũng
STT Thành phần Thể tớch
1 H20 2 àl
2 T4 DNA Ligase Reaction Buffe (5X) 1 àl
3 T4 ligase 5u/àl 1 àl
4 ADN 5 àl
5 pBT 1 àl
Hỗn hợp trờn đƣợc ủ ở 220C trong 1h 30 phỳt và 650C trong 10 phỳt, sau đú đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α.
2.2.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli
DH5
Sau khi găn san phõm đƣơc biờn nap vao E. coli DH5. Cỏc khuẩn lạc
E.coli chƣa vectơ tai tụ hơp mang san phõm PCR đƣơc chon loc trờn mụi trƣơng LB chƣa ampixilin , IPTG va Xgal .
Phƣơng phap biờn nap ADN plasmid vào tế bào E. coli chủng DH 5 đƣơc tiờn hanh nhƣ sau :
- Lõy tờ bao kha biờn DH5 trong tu lanh – 750 C đờ trờn đa 30 phỳt. - Trụn 4l dung dich phan ƣng găn (ligate) vào ống tế bào khả biến , sau
đo đờ trờn đa 30 phỳt.
- Sục nhiờt ơ 420C, thơi gian 1 phỳt 30 giõy, sau đo đờ trờn đa 2 phỳt. - Bụ sung 300 l mụi trƣơng LB long , sau đo nuụi lăc tục đụ 200 v/p
370C trong 1 giơ.
- Cõy trai toan bụ dich tờ bao đa biờn nap trờn mụt đia mụi trƣơng LB đăc (pepton, cao nõm men, NaCL va agar) chƣa ampixilin (100g/ml), Xgal va IPTG.
- Giƣ đia cõy vi khuõn trong tu õm 370C qua đờm.
2.2.3.6. Phương phỏp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
Kết quả của quỏ trỡnh biến nạp là tổ hợp của cỏc khuẩn lạc xanh và trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony - PCR với cặp mụ̀i pUC18-F1/pUC18-R1.
Thành phần phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khỏc cặp mụ̀i sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc, nhiệt độ gắn mụ̀i 530C. Điện di sản phẩm colony-PCR trờn gel agarose 1% để chọn ra cỏc khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đụ̀ng thời, nuụi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng cú bổ sung ampicillin 100mg/l để tỏch plasmid.
2.2.3.7. Tỏch chiờt plasmid
- Lõy 1,5 ml dich n uụi cõy vao ụng eppendorf . Ly tõm 5000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt để thu cặn tế bào.
- Bụ sung 150 l dung dich I , trụn đờu băng may voltex . - Bụ sung 150l dung dich II , đao nhe băng tay khoang 3 lõn.
- Tiờp tuc bụ sung 150l dung dich III , đao nhe băng tay khoang 3 lõn. - Thờm 400l chlorofom : isoamyl alcohol (24:1) đao nhe.
- Ly tõm 13.000 vũng/ phỳt trong 15 phỳt.
- Dựng pipet hỳt 400l Natri axetat 3M, pH 5.2 và 1ml cụn 100%. Đờ ADN- plasmit tua – 200C it nhõt 2 giơ.
- Ly tõm13.000 vũng/ phỳt trong10 phỳt, loại bỏ dịch nổi thu cặn AD-Nplasmid. - Rƣa căn ADN- plasmit 1 lõn băng 600l cụn 70%.
- Ly tõm 13.000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt, thu căn - Làm khụ cặn ADN – plasmid trong box cõy .
- Hũa cặn ADN- plasmit trong 40 l TE co ARNase (nụng đụ 100l/ml). - Ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1 giơ đờ loai ARN .
- Kiểm tra Sản tỏch plasmid trờn gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đú gel đƣợc nhuộm trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ỏnh sỏng đốn cực tớm.
2.2.3.8. Phương phỏp xỏc định trỡnh tự gen bằng thiết bị tự động
Xỏc định trỡnh tƣ ADN theo phƣơng phap thụng dung nhõt đo la xac đinh trƣc tiờp thụng qua phan ƣng kờt thuc đõu cuụi - phƣơng phap enzym e của Sanger (1977). Vơi cac đoan mụi co găn huynh quang va bụ hoa chõt chuõn(kit) để nhõn trỡnh tự gen băng PCR vơi Taq ADN polymerase. Chu trinh nhiờt: 950C 36 giõy, 500C 36 giõy, 720C 84 giõy, kờt thuc ơ 40C. Sau đo san phõm nhõn gen cú gắn huỳnh quang đƣợc biến tớnh bằng nhiệt và phõn tớch trờn mỏy xỏc định trỡnh tự ADN tự độ ng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. Sụ liờu nhõn đƣơc xƣ ly trờn may vi tinh băng phõn mờm Clustalx.
Chƣơng 3
KấT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA HẠT VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIấN CỨU GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIấN CỨU
3.1.1. Đặc điểm hình thỏi, kớch thƣớc và khối lƣợng hạt 5 giống đậu tƣơng nghiờn cứu
Hỡnh thỏi và khối lƣợng hạt là một trong những đặc tớnh quan trọng đƣợc quan tõm trong cụng tỏc chọn tạo giống đậu tƣơng. Kết quả phõn tớch đặc điểm hỡnh thỏi của 5 giống đậu tƣơng địa phƣơng theo cỏc tớnh trạng màu sắc hạt, màu sắc rốn hạt, sụ lƣơng, khối lƣợng hạt đƣợc trỡnh bày ở hỡnh 3.1và bảng 3.1.
Bảng 3.1. Màu sắc, sụ lƣơng và khối lƣợnghạt của 5 giống đậu tƣơng nghiờn cứu
Giống Màu vỏ hạt Màu rốn hạt Khối lƣợng 1000 hạt (g) Thỏi Nguyờn Vàng Đen 68 DT84 Vàng Nõu 145
BD Vàng phơt xanh Nõu 70
BH Vàng Đen 106
Cỳc
Tuyờn Vàng Đen 68
Bảng 3.1 cho thấy hầu hết màu vo hat của cỏc giống đậu tƣơng chủ yếu cú màu vàng và vàng pha. Màu sắc rốn hạt cú màu nõu và đen, đõy là một đặc tớnh quan trọng trong việc giỏm định giống.
Cỏc giống đậu tƣơng khỏc nhau cú khối lƣợng khỏc nhau, khối lƣợng 1000 hạt phụ thuộc vào kớch thƣớc và độ đụ̀ng đều của hạt. Thƣơ ng kớch thƣớc hạt lớn thỡ khối lƣợng 1000 hạt sẽ cao. Khối lƣợng hạt của 5 giống đậu tƣơng nghiờn cƣu dao động từ 68g đến 106g. Trong cỏc giống địa phƣơng thỡ giống BH cú khối lƣợng 1000 hạt cao nhất 106g vƣợt hẳn so với cỏc giống đậu tƣơng cũn lại, thấp nhất là giống TN va CT cú khối lƣợng 68g. Cú thể xếp theo thứ tự từ cao đến thấp về khối lƣợng 1000 hạt của cỏc giống đậu tƣơng nhƣ sau: DT84 >BH >BD>TN,CT.
3.1.2. Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tƣơng
Đờ đanh gia kha năng chiu han cua cac giụng đõu tƣơng gop phõn đinh hƣơng cho viờc chon cac giụng chiu han co hiờu qua , chỳng tụi tiến hành trụng thi nghiờm va gõy han nhõn tao khi cõy non xuõt hiờn 3 lỏ thật nhằm nghiờn cƣu đanh gia nhanh kha năng chiu han của cỏc giống đậu tƣơng thụng
qua theo doi cac chi tiờu : Tỉ lệ cõy khụng hộo , tỉ lệ cõy phục hụ̀i sau 3, 5 và 7 ngày và xỏc định chỉ số chịu hạn tƣơng đối , kết quả trỡnh bày trờn bảng 3.2.
A
Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 9 ngày
B
Hỡnh 3.2. Hỡnh ảnh cõy đậu tƣơng non 3 lỏ
Bảng 3.2. Khả năng chiu hạn của cỏc giụng đậu tƣơng nghiờn cứu
STT Tờn giống Chỉ số chịu hạn tƣơng đụi (%) Sụ ngày hạn cõy chờt 100 % (ngày) 1 Thỏi Nguyờn 1682,99 13 2 DT84 215,07 11 3 Bản Dốc 3595,77 15 4 Vàng Bắc Hà 1880,13 14 5 Cỳc Tuyển 262,07 12
Khi bị hạn, lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gõy tổn thƣơng cho cõy. Cỏc giống cõy khỏc nhau sẽ cú những đỏp ứng khỏc nhau để làm giảm hoặc trỏnh bị tổn thƣơng. Theo dừi thớ nghiệm cho thấy sau khi xử lý hạn tại thời điểm hạn 3 ngày cõy đậu tƣơng bắt đầu bị ảnh hƣởng một số cõy bị hộo lỏ, những ngày hạn tiếp theo mức độ ảnh hƣởng tăng lờn rừ rệt. Từ kết quả đỏnh giỏ khả năng chịu hạn thụng qua cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu tỉ lệ cõy khụng hộo sau 3, 5, 7 ngày hạn và lờ cõy phuc hụi sau 3, 5, 7 ngày hạn , chỳng tụi đó tớnh toỏn đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của cỏc giống đậu tƣơng ở giai đoạn cõy non 3 lỏ. Giống BD cú chỉ số chịu hạn cao nhất (Sn = 3595,77 ) sau đú là giống Vàng Bắc Hà (Sn = 1880,13), thấp nhất là giống DT84 (Sn = 215,07). Những giống cú chỉ số chịu hạn tƣơng đối lớn thỡ cú khả năng chịu hạn càng cao và ngƣợc lại. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cõy non 3 lỏ của 5 giống đậu tƣơng cú thể xếp theo thứ tự: BD > BH> TN> CT> DT84. Nhƣ vậy, ở giai đoạn cõy non giống BD cú khả năng chịu hạn tốt nhất. giống DT84 cú khả năng chịu hạn thõp nhất . Tỷ lệ cõy chết 100% sau thơi gian xƣ ly han giụng DT84 11 ngày, Cỳc tuyển 12 ngày, Thỏi nguyờn 13 ngày, Vàng Bắc Hà và Bản Dốc là 14 và 15 ngày tƣơng ứng .
3.2. KấT QUA PHÂN LẬP VA XAC ĐINH TRèNH TỰ GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
3.2.1. Kết quả tỏch chiết ARN tụng sụ
Hạt đậu tƣơng tỏch từ quả non của giống Thỏi Nguyờn đƣơc sƣ dung đờ tỏch chiết ARN tổng số . Quả đƣơc giữ ở - 85°C cho đến khi sử dụng. Hạt tỏch tƣ qua non đƣơc nghiờn than h bụt min trong cụi chay sƣ . Chỳng tụi sử dụng bộ Kit Trizol Reagents (của hóng Invitrogen) để tỏch chiết RNA tổng số. Sau khi phõn tach , kiểm tra san phẩm ARN tỏch chiết đƣợc bằng phƣơng phỏp điện di trờn gel agarose 0,8%, kết quả thờ hiờn ơ hinh 3.3.
Hỡnh 3.3. Kết quả tỏch chiết RNA tổng số
Kết quả (hỡnh 3.3) cho thấy ARN tổng số thu đƣợc cú hàm lƣợng cao, chất lƣợng tốt, đảm bảo cho việc tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo. Tuy nhiờn, chỳng tụi khụng sử dụng hệ đệm đặc trƣng cho phõn tỏch ARN nờn khụng thể phõn tỏch cỏc băng của ARN tốt.
Do ARN là loại phõn tử khụng bền, dễ bị thủy phõn bởi cỏc ribonuclease (RNase). Hơn nữa cỏc RNase lại cú mặt khắp nơi, hoạt tớnh mạnh và rất bền. Vỡ thế, việc tỏch chiết ARN đũi hỏi phải thao tỏc thật cẩn thận để trỏnh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ mụi trƣờng, tất cả cỏc dụng cụ phải đƣợc xử lý trƣớc khi tiến hành thớ nghiệm: cối chày sứ đƣợc xử lý ở 1210C trong 3 giờ,
cỏc dụng cụ nhƣ ống eppendorf, đầu tớp,… đƣợc xử lý trong DEPC 0,1%, cỏc húa chất khỏc (cụ̀n 700, H2O) đƣợc pha trong nƣớc 0,1% DEPC.
Trong quỏ trỡnh tỏch chiết, việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng để phỏ vỡ thành tế bào và giải phúng cỏc thành phần trong tế bào đũi hỏi phải thao tỏc nhanh. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn phải bổ sung ngay Trizol rengents. Nếu khụng, nuclease nội bào đƣợc giải phúng sẽ thủy phõn ARN. Cỏc thành phần trong Trizol reagents nhƣ phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chúng biến tớnh protein, polysaccarit cú trong hỗn hợp. Việc bổ sung thờm Chloroform: Isoamine (24 : 1) cú tỏc dụng kết tủa những chất trờn và tỏch pha tốt trong quỏ trỡnh ly tõm. Sản phẩm ARN tổng số đƣợc hũa tan trong nƣớc 0,1% DEPC cú tỏc dụng ngăn cản quỏ trỡnh RNase thủy phõn RNA.
3.2.2. Kết quả khuếch đai gen Cystatin
Từ ARN tổng số, chỳng tụi tiến hành phản ứng RT-PCR với cặp mụ̀i đặc hiệu (Cys-SoyF va Cys SoyR). để nhõn gen cystatin . Theo ti nh toỏn lý thuyết sẽ nhõn đƣơc băng DNA cú kớch thƣớc khoảng 738 bp.
Để kiểm tra kết quả sản phẩm RT -PCR, chỳng tụi tiến hành điện di trờn gel agarose 1%, Kết quả đƣơc thể hiện ở hỡnh 3.4.
bp
1000 750 500
Kết quả RT-PCR trờn hỡnh 3.4 cho thấy, đó nhõn đƣợc mụt băng ADN cú kớch thƣớc khoảng xấp xỉ 750 bb. Kết quả này hoàn toàn phự hợp với sụ liờu tinh toỏn lý thuyết thiết kế cặp mụ̀i.
Cú rất nhiều yếu tố cú thể ảnh hƣởng tới chất lƣợng của phản ứng RT- PCR nhƣ: lƣợng ARN quỏ ớt hoặc quỏ nhiều, nụ̀ng độ mụ̀i quỏ cao hoặc quỏ thấp, nhiệt độ gắn mụ̀i chƣa phự hợp,.... Vỡ vậy, trong quỏ trỡnh tiến hành phản ứng, cần điều chỉnh hàm lƣợng cỏc thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nụ̀ng độ mụ̀i, nhiệt độ gắn mụ̀i, Mg2+, thời gian đối với mỗi bƣớc của chu kỳ nhiệt,…) để phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Để loại cỏc tạp chất nhƣ muối, cỏc nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mụ̀i, enzyme, đệm,… Vỡ thế để