Thiết bị
Máy ly tâm (Mikro 200 – Hittich/Đức) Máy PCR 9700 (ABI – Mỹ)
Máy PCR iCycler (Biorad – Mỹ) Lò vi sóng
Tủ hút
Buồng thao tác PCR Block gia nhiệt Máy khuấy từ Máy cất nước 2 lần
Máy điện di mao quản: sequnencer 3130 Dụng cụ
Pipet các loại
Ống Eppendorf các loại Plate 96 giếng
Đầu côn các loại Găng tay cao su
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân tích ADN
2.2.1.1 Phƣơng pháp tách chiết
Phương pháp tách chiết ADN từ máu theo phương pháp tách chiết vô
cơ sử dụng chelex100
Nguyên tắc : Chelex® 100 Resin là hợp chất hóa học có ái lực cao với những ion kim loại đa hóa trị. Nó là chất tạo bởi styren và divinyl benzen có
mặt của Chelex trong khi đun ở nhiệt độ 1000C sẽ ngăn cản quá trình biến tính của DNA bởi các tác nhân ion kim loại tạo phức có thể xúc tác cho quá trình đứt gãy ở nhiệt độ cao trong những dung dịch có cường độ ion thấp. Chelex còn liên kết cả với những chất bẩn là chất ngăn cản quá trình diễn ra phản ứng PCR. Tách chiết DNA sử dụng Chelex là phương pháp vô cơ.
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác đơn giản, tốn ít thời gian và DNA không bị hao hụt nhiều trong quá trình tách chiết. Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA bằng chelex 100 để tách DNA trên các mẫu máu [4].
Quy trình tách chiết bằng chelex 100 như sau:
Cắt khoảng 3x3 mm mẫu cho vào ống ly tâm 1,5 ml Cho 1 ml nước tinh khiết đã khử ion vào ống
Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút để rửa mẫu Chuẩn bị dung dịch chelex 5% bằng cách pha 5 g chelex vào 100 ml nước khử ion
Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút
Thêm 200 µl dung dịch chelex 5% vào ống đựng mẫu Ủ hỗn hợp ở 56o
C trong vòng 30 phút Trộn bằng vortex trong 5 giây
Ủ hỗn hợp ở 100o
C trong khoảng 8 phút Trộn bằng vortex trong 5 giây
Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút Thu dịch nổi cho sang ống mới.
2.2.1.2 Phƣơng pháp định lƣợng ADN
Sản phẩm DNA thu được sau quá trình tách chiết được định lượng bằng bộ kit “Quantiblot Human DNA Quantitation kit” của hãng Perkin Elmer (Mỹ).
Nguyên tắc:
Định lượng DNA bao gồm quá trình lai đầu dò có gắn biotin với DNA cần định lượng. Mẫu DNA cần định lượng được cố định trên màng nilon. Đầu dò đặc hiệu đối với đoạn lặp của locus gen D17 Z1. Một enzym liên kết HRP – SA gắn vào đầu kia của biotin. Enzym này xúc tác quá trình oxy hóa của Chromogen TMB để tạo thành kết tủa màu xanh trên màng nilon. Lượng kết tủa màu xanh sẽ biểu thị tỷ lệ lượng DNA.
Cách tiến hành
- Chuẩn bị mẫu DNA cần định lượng và DNA chuẩn. Sau đó gắn DNA lên màng nilon. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sau đó lai giữa đầu dò và mẫu. Giai đoạn này sử dụng đầu dò D17 Z1 và enzim HRP - SA.
- Giai đoạn hiện màu, sử dụng Chromogen TMB và H2O2.
- Đánh giá kết quả căn cứ vào mức độ kết tủa màu và mẫu DNA chuẩn để đánh giá. Mức độ đậm nhạt khác nhau là tùy thuộc vào lượng DNA nhiều hay ít.
2.2.1.3 Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của phương pháp PCR
Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung
Thành phần hóa chất tham gia thực hiện phản ứng PCR
AmpFlSTR Yfiler Primer Set
AmpFlSTR Yfiler PCR Reaction Mix AmpFlSTR Control DNA 007
AmpliTaq Gold® DNA Polymerase AmpFlSTR Control DNA 9947A AmpFlSTR Yfiler Allelic Ladder
Đây la thành phần trong bộ kít AmpFℓSTR® Yfiler® PCR Amplification
ADN tách chiết từ 80 mẫu máu nghiên cứu
Các bước tiến hành
Bước 1: Thực hiện qúa trình biến tính DNA bằng nhiệt
Sử dụng 1ng DNA tách chiết được từ mẫu nghiên cứu vào dung dịch phản ứng (gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép), tăng nhiệt độ của dung dịch lên tới 94÷95°C, thời gian lưu tương ứng 1 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Bước 2: Thực hiện phản ứng lai
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 62°C và thời gian lưu 1 phút. Lúc này mồi bắt cặp với sợi khuôn. Mồi có mồi ngược và xuôi. Người ta còn có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó DNA- polymerase được sử dụng để kéo dài mồi.
Bước 3: Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension) Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C trong 1 phút để DNA-polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi
DNA cần khuếch đại. Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kép con.
Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 30 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 60°C trong 80 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm.
2.2.1.4 Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis – CE)
Nguyên lý: Điện di mao dẫn là dùng tia lase kích hoạt các đoạn ADN mồi đã được gắn huỳnh quang để thu được các phổ quang học.
Các bước tiến hành
Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di mao quản) trên máy giải trình tự gen 3130 của hãng Applied Biosystems. Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang. Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange) tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó. Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 để xác định các alen của mỗi locus.
Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chuẩn bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng như sau:
Bảng 2.1: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao quản
Thành phần Thể tích
Hi-DiTM Formamide 8,7 µl
GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 µl
Mẫu (Thang alen) 1,5 µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng 10,5 µl
Hỗn hợp phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95oC trong vòng 4 – 5 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào đá lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính và làm lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết DNA từ dạng mạch đôi sẽ chuyển sang dạng mạch đơn hoàn toàn.
2.2.2 Phân tích dữ liệu ADN 2.2.2.1 Phân tích ADN
Từ dữ liệu thô trên máy giải trình tự ABI-3130, với máy tính chuyên dụng sử dụng phần mệm GeneMapper ID phân tích kiểu gen hệ Y-STR từ các mẫu trên
2.2.2.2 Tính toán thống kê.
Tần suất alen và tần suất haplotype được tính toán theo phương pháp đếm đã nêu ở trên. Chỉ số locus và chỉ số haplotype được tính toán theo công thức sau:
Trong đó N là số lượng cá thể nghiên cứu. Pi là tần suất haplotype thứ i. Chỉ số locus cũng được tính theo công thức trên, nhưng thay tần suất haplotype là tần suất alen.
Sử dụng công cụ trực tuyên trên cơ sở dữ liệu YHRD để so sánh khoảng cách di truyền với người Việt (Kinh) và với quần thể người ở các nước lân cận. Để kiểm tra mối quan hệ giữa quần thể nghiên cứu và các quần thể khác, chúng tôi dựa trên phương pháp tính phương sai (AMOVA) với tính toán khoảng cách di truyền Фst và P (xác suất liên quan đến kiểm định). Khoảng cách di truyền Фst mô tả mối tương quan giữa sự đa dạng phân tử của haplotype ngẫu nhiên giữa hai quần thể tương đối cho các cặp ngẫu nhiên của haplotype rút ra từ toàn bộ loài
Фst=(πt-πs)/πt
Trong đó πt là chỉ số đa dạng chuỗi nucleotide trong quần thể, πs là trung bình của các chỉ số đa dạng trình tự nucleotide trong quần thể. Để tính toán có ý nghĩa giá trị P được tính toán với 10000 hoán vị. Mức ý nghĩa cho thông ke P<0,05. Locus DYS385 không được tính khi so sánh các quần thể.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết ADN bằng phƣơng pháp vô cơ sử dụng chelex 100
Trong 80 mẫu thu được, tiến hành tách chiết với phương pháp vô cơ sử dụng chelex 100. Định lượng ADN người bằng phương pháp Quantiblot. Vì mẫu máu thu tại Viện Khoa học hình sự, đạt theo tiêu chuẩn thu và bảo quản mẫu giám định, nên chúng tôi chỉ tiến hành định lượng trên 10 mẫu ngẫu nhiên để giảm thiểu chi phí thí nghiệm, cho kết quả như sau:
Bảng 3.1: Kết quả định lƣợng ADN từ 10 mẫu nghiên cứu ngẫu nhiên
Mẫu số Hàm lượng DNA (ng/µl)
1 18 5 16 5 16 13 19 26 14 34 13 47 20 59 18 62 14 71 19 80 17
Kết quả cho thấy các mẫu ADN đã tách có hàm lượng trung bình khoảng 17ng/ul, và chỉ sử dụng 1ng cho phản ứng PCR.
3.2. Kết quả PCR
Thực hiện phản ứng PCR từ 80 mẫu ADN tách chiết được, sau khi điện di trên máy giải trình tự 3130, chúng tôi thu được đầy đủ các kiểu gen hệ 17 locus Y-STR từ các mẫu trên.
Hình 3.1: Hình ảnh pic 17 locus Y-STR sau điện di huỳnh quang
3.3. Phân tích alen và tính toán tần suất Y-STR haplotype
Sau khi có đầy đủ kiểu gen hệ Y-STR của 80 người nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm để quan sát tính đa hình alen trên từng locus và tính toán chỉ số đa hình locus và đa dạng haplotype, cho kết quả như sau:
Bảng 3.2: Bảng đa hình các alen quan sát đƣợc khi nghiên cứu
Locus Y-STR Số alen quan sát alen
DYS19 6 13-18 DYS389I 5 11-15 DYS389II 6 27-32 DYS390 5 20, 23-26 DYS391 4 9-11, 16 DYS392 5 11-15
DYS438 4 9-12 DYS439 4 11-14 DYS437 2 14-15 DYS448 6 15, 17-21 DYS456 5 13-17 DYS458 8 14-21 DYS635 7 19-26 YGATH4 5 10-14 DYS438 4 9-12 DYS385 31 (11-12)-(18-20)
Bảng 3.3: Tần suất alen 17 locus Y-STR phân tích từ 80 ngƣời nghiên cứu ALEN DYS 456 DYS 389I DYS 390 DYS 389II DYS 458 DYS 19 DYS 393 DYS 391 9 0,025 10 0,6375 11 0,025 0,325 12 0,3125 0,325 0 13 0,175 0,3875 0,0125 0,2 0 14 0,075 0,2625 0,0375 0,1 0,4625 0 15 0,5125 0,0125 0,1875 0,375 0,0125 0 16 0,2 0,1625 0,4125 0,0125 17 0,0375 0,1375 0,075 18 0,3125 0,0125 19 0,075 20 0,0125 0,0625 21 0 0,025 22 0 23 0,1125 24 0,45 25 0,3875
28 0,1875 29 0,375 30 0,3375 31 0,075 32 0,0125 14,3 0,0125 GD 0,643 0,691 0,641 0,713 0,821 0,681 0,648 0,493 Bảng 3.3: Tiếp theo ALEN DYS 439 DYS 635 DYS 392 DYS GATAH 4 DYS 437 DYS 438 DYS 448 9 0,0125 10 0,075 0,8375 11 0,3375 0,0625 0,475 0,1375 12 0,5375 0,025 0,375 0,0125 13 0,0875 0,725 0,05 14 0,0375 0,1625 0,025 0,8 15 0,025 0,2 0,0125 16 0 17 0,0375 18 0,45 19 0,025 0,3 20 0,1125 0,1125 21 0,4125 0,0875 22 0,15 23 0,2 24 0,0875 25 0,0125 26 27 28 29 30 31 32 14,3 GD 0,596 0,756 0,448 0,633 0,323 0,283 0,694
Bảng 3.3 Tiếp theo : Tần suất alen locus DYS385a/b ALEN DYS 385a/b ALEN DYS 385a/b 13-19 0,1375 12-18 0,0125 18-20 0,0125 12-19 0,0375 13-13 0,0375 15-21 0,0125 12-20 0,0625 12-15 0,025 13-17 0,0125 14-19 0,0875 16-20 0,025 14-21 0,0125 13-22 0,0125 13-21 0,0125 14-18 0,0375 11-12 0,0125 15-19 0,0875 17-20 0,025 12-16 0,0125 16-18 0,0125 17-18 0,0125 11-14 0,0125 13-18 0,15 13-20 0,0125 13-23 0,0125 15-15 0,025 13-14 0,0375 12-21 0,0125 15-20 0,0125 16-19 0,0125 13-15 0,0125 GD=0,943 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ những số liệu alen quan sát được, chúng tôi đã tính toán tần suất từng alen và tần suất của haplotype phân tích được (kết quả được trình bày trong phụ lục), cho thấy:
Chúng tôi thu được 56 alen ở 17 locus Y-STR, 77 Haplotype duy nhất và 3 haplotype được tìm thấy 2 lần. Chỉ số đa dạng haplotype là 0,9994.
Chỉ thị di truyền đa hình nhất là DYS385a/b, chỉ số đa dạng locus là 0,943 và chỉ thị di truyền it đa hình nhất là DYS438 với chỉ số locus là 0,283. Ngoài locus DYS385, các locus DYS458, DYS389II, DYS635, DYS448, DYS389I và DYS19 cũng có chỉ số locus khá cao. Locus DYS458 có khoảng alen khác nhau lớn nhất. Tại locus DYS19 có alen trung gian là
Hình 3.2: Đồ thị mô tả chỉ số đa dạng locus gen hệ 17 Y-STR
3.4. Kết quả sử dụng công cụ trực tuyến YHRD để tính khoảng cách di truyền giữa quần thể nghiên cứu và các quần khoảng cách di truyền giữa quần thể nghiên cứu và các quần thể có sẵn trong cơ sở dữ liệu
Chúng tôi so sánh kết quả với dữ liệu haplotype của người Việt (Kinh) ở khu các khu vực của Việt Nam trên cơ sở dữ liệu YHRD, cho thấy có sự khác biệt nhỏ với người Việt (Kinh) ở Hà Nội (Фst=0,0115; P=0,0281) và ở TP Hồ Chí Minh (Фst=0,0129; P=0,0321).
Bảng 3.4: Bảng giá trị của Фst và P giữa quần thể Việt đã nghiên cứu và dữ liệu có sẵn trên YHRD (trong bảng giá trị P ở trên, giá trị Фst ở dưới)
Population Hanoi Ho-Chi-Minh Viet Nam
Hanoi - 0.1042 0.0115
Ho-Chi-Minh 0.0147 - 0.0129
Viet Nam 0.0281 0.0321 -
Từ kết quả trên, ta thấy quần thể người Việt (Kinh) mà chúng tôi đang nghiên cứu khá tương đồng với quần thể người Việt từ Hà Nội và Thành Phố
nghiên cứu là thỏa mãn yêu cầu về độ tin cậy. Ngoài ra có sự sai lệch khoảng cách di truyền, điều đó chứng tỏ quần thể người Việt khá đa dạng, nên việc nghiên cứu với số lượng mẫu lớn sẽ quan sát được đầy đủ cấu trúc di truyền hơn.
Chúng tôi cũng so sánh dữ liệu nghiên cứu với các quần thể của các nước láng giềng như: Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Philippin và một số nước xa hơn như Hàn Quốc và Đài Loan.
Bảng 3.5: Bảng giá trị Фst và P giữa quần thể ngƣời Việt (Kinh) đã nghiên cứu và quân thể các nƣớc lân cận
Population Indonesia Philippines S.Korea Taiwan Thailand Viet Nam China
Indonesia - 0.0000 0.0000 0.0000 0.0011 0.0000 Philippines 0.0533 - 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 S. Korea 0.1322 0.1597 - 0.0000 0.0000 0.0000 Taiwan 0.2863 0.1672 0.3871 - 0.0000 0.0000 Thailand 0.0708 0.2095 0.1787 0.5448 - 0.1993 Viet Nam 0.0830 0.1927 0.1336 0.5334 0.0081 - 0.1058 China 0.0000 -
Từ bảng số liệu trên, cho kết quả khoảng cách di truyền quần thể người Việt (Kinh) đang nghiên cứu với các quần thể khác như sau: Trung (Фst=0,1058; P=0.0000), Indonesia (Фst=0,0830; P=0,0000), Philippines
(Фst=0,5334; P=0,0000), Riêng số liệu với Thái Lan có P>0,05 nên không có ý nghĩa trong thống kê.
Trong vài năm gần đây, Các nước trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc di truyền với các chỉ thị di truyền gồm 7, 9 hoặc 11 Y-STR. Ở nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng với 17 chỉ thị di truyền với quần thể người Việt (Kinh) ở Việt Nam, cho thấy:
Phân tích tính đa hình gen di truyền ở 17 locus Y-STR trong quần thể 80 người đàn ông Việt (Kinh), cho thấy chỉ số đa dạng gen của quần thể người Việt (Kinh) khá cao. Trong đó cao nhất được tìm thấy ở locus DYS385. So sánh tần suất haplotype hệ 17 Y-STR của 80 người được nghiên cứu với quần thể người Việt (Kinh) ở Hà Nội và TP Hồ Chí Minh trên cơ sở dữ liêu YHRD (http://www.yhrd.org) thấy có khác biệt nhỏ. Do số mẫu nghiên