tƣơng đồng 99% so với chủng Pseudomonas sp. DRJS2 và Pseudomonas
aeruginosa DMS 50071T nên 2 chủng này đƣợc đƣợc định danh lần lƣợt là
Pseudomonas sp. DGP4 và Pseudomonas sp. DGP8, đƣợc đăng ký với mã số KJ748401 và KJ700307 trên ngân hàng gen NCBI.
3.3. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng sinh học học
Khả năng sinh trƣởng và phát triển cũng nhƣ khả năng tạo màng sinh học phu thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó các yếu tố hóa lý có ảnh hƣởng lớn nhất và trực tiếp nhất. Nghiên cứu các điều kiện hóa lý (pH, nhiệt độ, nguồn carbon, nguồn nitor ...) nhằm xác định điều kiện tối ƣu cho vsv phát triển, từ đó có thể kiểm soát quá trình phát triển của vsv theo mong muốn và đạt hiệu quả tạo biofilm cũng nhƣ khả năng phân hủy phenol tốt nhất.
3.3.1. Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH có ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh trƣởng và phát triển của các vsv. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nuôi 3 chủng vi khuẩn trong 3 ngày, lần lƣợt ở các giá trị pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 và pH 9 để tìm ra giá trị pH tối ƣu. Cứ sau 24h nuôi cấy, chúng tôi đánh giá khả năng tạo biofilm của 3 chủng này. Kết quả thu đƣợc qua đo mật độ quang ở bƣớc sóng 570 nm đƣợc thể hiện qua hình 3.10.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn
Từ biểu đồ hình 3.10, ta thấy các chủng vi khuẩn đều sinh trƣởng phát triển và tạo màng tốt ở pH 7 sau 24 giờ nuôi cấy. Từ đó, chúng tôi xác định giá trị pH 7 là giá trị tối ƣu cho sự sinh trƣởng và khả năng tạo màng của 3 chủng nghiên cứu.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bên cạnh giá trị pH thì nhiệt độ cũng là yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và tạo màng.Mỗi chủng vsv đều phát triển tốt trong một khoảng nhiệt độ nhất định.Ngoài khoảng nhiệt độ đó, chúng sẽ bị hạn chế sinh trƣởng hoặc bị chết nhanh chóng. Để tìm khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của vsv và khả năng tạo biofilm, chúng tôi tiến hành nuôi 3 chủng vi khuẩn trong môi trƣờng HKTS dịch (pH 7) ở 25o
C, 30oC, 37oC, 40oC, 45oC và 50oC trong 3 ngày. Cứ sau 24 giờ nuôi cấy, chúng tôi đánh giá khả năng tạo biofilm bằng đo giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lập lại 3 lần. Kết quả thu đƣợc thể hiện qua biểu đồ hình 3.11. 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 4 5 6 7 8 9 OD 57 0 nm pH BDGP2 BDGP4 BDGP8 OD 570 nm ĐGP8 ĐGP4 ĐGP2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn
Quan sát hình 3.11 cho thấy cả 3 chủng vi khuẩn đều sinh trƣởng tốt nhất ở khoảng nhiệt độ 30 đến 35oC, đặc biệt là ở 30oC, trong 48 giờ. Từ đó, chúng tôi xác định 30oC là nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và tạo màng của 3 chủng vi khuẩn.
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Mỗi vsv sinh trƣởng phát triển tốt nhất trên một nguồn cơ chất nhất định. Để tìm ra nguồn cơ chất thích hợp nhất cho 3 chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng trên các nguồn carbon là saccharose, glucose, mantose và lactose tại pH 7, 30oC trong 3 ngày. Cứ sau 24 giờ, chúng tôi kiểm tra khả năng tạo màng của từng chủng bằng đo giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 570 nm. Kết quả thu đƣợc thể hiện qua hình 3.12. 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h
25oC 30oC 35oC 40oC 45oC 50oC
BDGP2 BDGP4 BDGP8 45oC 40oC 35oC 30oC 25oC ĐGP2 ĐGP4 ĐGP8 50oC Nhiệt độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Từ hình 3.12 cho thấy, các chủng sinh trƣởng tốt nhất trên nguồn carbon saccharose ở 48 giờ. Nhƣ vậy, đây chính là nguồn carbon tối ƣu đối với khả năng sinh trƣởng và tạo màng của 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu.
3.3.4. Ảnh hưởng của nguồn nitor
Bên cạnh nguồn carbon thì nguồn nitor cũng có ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và tạo màng của các chủng vi khuẩn. Để đánh giá ảnh hƣởng của nguồn nitor, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng trên môi trƣờng có bổ sung KNO3, NaNO3, cao men và pepton ở pH 7, nhiệt độ 30oC, nguồn carbon saccharose trong 72 giờ. Cứ sau mỗi 24 giờ, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng tạo màng của 3 chủng vi khuẩn bằng đo mật độ quang ở bƣớc sóng 570 nm. Mỗi thí nghiệm đo OD đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.13.
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h Saccharose Glucose Mantose Lactose
OD 570 nm BDGP2 BDGP4 BDGP8ĐGP8 ĐGP4 ĐGP2 Nguồn carbon
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitor lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Quan sát hình 3.13 cho thấy, các chủng vi khuẩn sinh trƣởng tốt nhất ở nguồn nitor KNO3 ở 48 giờ. Từ đó, chúng tôi xác định KNO3 là nguồn nitor tối ƣu cho sự sinh trƣởng phát triển và tạo màng của 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu.
3.4. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm đa chủng tạo thành ở điều kiện tối ưu kiện tối ưu
Để đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm từ các chủng tuyển chọn, chúng tôi tiến hành nuôi tĩnh hỗn hợp các chủng đã chọn lọc trên môi trƣờng HKTS 50 ml để tạo màng. Sau 48 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Sau đó bổ sung môi trƣờng khoáng dịch và phenol ở các nồng độ 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm và 200 ppm. Đem nuôi tĩnh ở 30o
C, mẫu dịch tế bào đƣợc chiết rút sau mỗi 24 giờ để phân tích, xử lý. Sau 7 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện qua hình 3.14. 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h Saccarose + Natri Saccarose + Kali Saccarose + Cao men Saccarose + pepton OD 570 nm BDGP2 BDGP4 BDGP8
NaNO3 KNO3 Cao men Pepton Nguồn nitor
ĐGP2 ĐGP4 ĐGP8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.14. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của màngsinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành ở các nồng độ phenol khác nhau
Từ hình 3.14 chúng tôi nhận thấy, sau 7 ngày thí nghiệm tại nồng độ phenol 150 ppm, khả năng chuyển hóa phenol là tốt nhất, theo đó mẫu thí nghiệm này đƣợc phân tích định lƣợng bằng phƣơng pháp đo quang.
Để đánh giá khả năng phân hủy phenol do 3 chủng vi khuẩn tạo thành, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lƣợng phenol trƣớc và sau thí nghiệm bằng phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn. Dựa trên đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng với các nồng độ phenol khác nhau, chúng tôi nhận thấy, sau 7 ngày xử lý, hàm lƣợng phenol còn lại trong mẫu thí nghiệm là 1,034 mg/l và trong mẫu đối chứng là 148,7 mg/l. Từ đó, chúng tôi tính toán đƣợc hiệu suất phân hủy phenol do màng sinh học đa chủng tạo thành là 99,3% và mẫu đối chứng là 0,87%. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 1 2 3 4 5 6 7 OD 600 nm 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm Ngày
47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy 150 ppm phenol của màng sinh học đa chủng của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm sau 7 ngày xử lý
Hiện nay, các công bố về khả năng phân hủy phenol của màng sinh học đa chủng ở trong nƣớc và trên thế giới còn hạn chế, các nghiên cứu về phân hủy phenol chỉ tập trung ở các chủng đơn lẻ hoặc các chủng vi sinh vật đƣợc cố định trên các vật liệu mang khác nhau. Năm 2009, Thomas và Leter đã phân lập đƣợc chủng Pseudomonas sp. từ lớp đất mặt của nhà máy sản xuất khí gas có khả năng phân hủy một hỗn hợp các chất bao gồm cresol, phenol, dimethylphenol và trimethylphenol trong đó hiệu suất phân hủy phenol lên đến 99%. Cũng trong năm 2009, Lin và cộng sự đã phân lập Pseudomonas fluorescens từ nƣớc thải công nghiệp có khả năng phân hủy 85,4% phenol từ 32g/l ban đầu (có bổ sung 1% glucose). Năm 2012, Cheng và cộng sự đã chỉ ra khả năng phân hủy phenol từ
chủng Ochorobactrum sp. CH10 có khả năng phân hủy phenol ở các nồng độ 400
ppm, 900 ppm, 1000 ppm trong 24, 44, 48 giờ với hiệu suất phân hủy tƣơng ứng là 100%, 92,3%, 82,2% (ở điều kiện pH 7, nhiệt độ 30oC). Năm 2010, Cung Thị Ngọc Mai và cộng sự đã phân lập đƣợc chủng BTL11 từ nƣớc thải khu công nghiệp có khả năng phân hủy 100 ppm phenol với hiệu suất 99% sau 14 ngày xử lý (có bổ sung 0,5% glucose). Năm 2013, Lê Thị Nhi Công và đồng tác giả đã phân lập đƣợc 4 chủng vi khuẩn B2, B8, B15 và B16 vừa tạo màng tốt, vừa phân hủy phenol cao.
0.87 99.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Đối chứng Thí nghiệm Hiệu suất ph ân hủ y (% ) Đối chứng Thí nghiệm 0,87 99,3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Màng sinh học do 4 chủng vi khuẩn này tạo thành có khả năng chuyển hóa 99% phenol sau 7 ngày xử lý với nồng độ ban đầu 150 ppm.
Nhƣ vậy, so với các công trình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam thì màng sinh học đa chủng do 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 tạo thành trong đề tài của chúng tôi vừa tạo màng tốt, vừa phân hủy phenol cao. Do đó, có thể ứng dụng các chủng vi khuẩn này trong việc xử lý phenol và các dẫn xuất khác của phenol gây ô nhiễm môi trƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ mẫu nƣớc thải bể chứa kho xăng dầu Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội phân lập
đƣợc 8 chủng vi khuẩn trên nguồn cơ chất phenol, trong đó 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 có khả năng sinh trƣởng và phát triển và tạo màng sinh học tốt nhất.
2. Các chủng ĐGP2, ĐGP4, ĐGP8 đƣợc định danh lần lƣợt là Ochrobactrum sp.
DGP2, Pseudomonas sp. DGP4 và Pseudomonas sp. DGP8. Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của 3 chủng đã đƣợc đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế với mã số lần lƣợt là KJ700308, KJ748401 và KJ700307.
3. Các chủng vi khuẩn ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 sinh trƣởng và phát triển tốt nhất trong 48 giờ, ở pH 7, nhiệt độ 30oC, nguồn carbon là saccharose và nguồn nitor là KNO3.
4. Màng sinh học do 3 chủng ĐGP2, ĐGP4, ĐGP8 tạo thành có khả năng phân hủy
99,3% nồng độ phenol ban đầu là 150 ppm sau 7 ngày nuôi cấy.
Kiến nghị
Mở rộng nghiên cứu khả năng phân hủy phenol của màng sinh học đa chủng ở quy mô lớn hơn để có thể áp dụng vào thực tiễn để xử lý môi trƣờng nƣớc bị ô nhiễm phenol và các nguồn ô nhiễm tƣơng tự.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Tô Kim Anh (2004), “Nghiên cứu giải pháp sinh học phân giải phenol và một số dẫn xuất của phenol”, Báo cáo đề tài nhánh cấp Nhà nước KC-04.
2. Lê Thị Nhi Công, Cung Thị Ngọc Mai, Nghiêm Ngọc Minh (2012), “Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học của chủng Rhodococcus sp. B2 phân lập từ kho xăng Đỗ Xá, Hà Nội”, Tạp chí Công nghệ sinh học 10(3): 563-569.
3. Trần Thuý Hằng (2011), Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học phân lập ở Việt Nam. Luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Trƣơng Thế Kỷ, Hoá hữu cơ 1: Hợp chất hữu cơ đơn chức và đa chức, Nhà xuất bản Y học.
5. Cung Thị Ngọc Mai, Trần Hải Đăng, Nguyễn Văn Bắc và cộng sự (2010), “Nghiên cứu khả năng phân huỷ hydrocarbon thơm đa nhân và phenol của chủng vi khuẩn BTL11 phân lập từ nƣớc thải khu công nghiệp”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học khu vực Miền trung và Tây Nguyên: 1739-1744.
6. Cung Thị Ngọc Mai, Trần Thị Khánh Vân, Nghiêm Ngọc Minh (2010), “Hình
thái tế bào và khả năng phân hủy PAH và phenol của chủng vi khuẩn BTL6 phân lập từ nƣớc thải khu công nghiệp”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 68(6): 101-106.
Tiếng Anh
7. Andersson S, Dalhammar G, Lan CJ, Kuttuva Rajarao G (2009),
“Characterization of extracellular polymeric substances from denitrifying organism Comamonas denitrificans”, Appl Microbiol Biotechnol 82(3):535-43.
8. Bidleman T, Walla M, Roura R, Carr E, Schmidt S (1993), “Organochlorine pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January- March, 1990”, Mar Pollut Bull 26(5): 258- 262.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
9. Bruce RM, Santodonato J, Neal MW (1987), “Summary review of the health effects associated with phenol”, Toxicol indust Health 3(4): 535-68.
10. Cerniglia CE (1992), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocacbons”, Current Opinion in Biotechnology 3: 331-368.
11. Cheng KC, Demicri A and Catchmark JM (2010), “Adances in biofilm reactors for production of value – added products”, Appl Microbiol Biotechnol 87(2): 445-456.
12. Costerton JW, Ingram JM, Cheng KJ (1974), “Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriol Rev 38(1): 87-110.
13. Davey ME, O’Toole GA (2000), “Microbial biofilm: from ecology to moclecular genetics”, Microbiol Mol Biol Rev 64(4): 847-867.
14. Donlan RM (2012), “Biofilm: microbial life on surfaces”, Emerg Infect Dis
8(9): 881-890.
15. Donlan RM, Pipes WO, Yohe TL (1994), “Biofilm formation on cast iron substrata in water distribution systems”, Water Research 28(6): 1497-1503.
16. Ghadi S and Sangodkar UMX (1994), “Identification of a meta-cleavage pathway for metabolism of phenoxyacetic acid and phenol in Pseudomonas cepacia AC1100”, Biochem Biophys Res Commun 204(2): 983-993.
17. García-Martínez J, Acinas SG, Antón AI, Rodríguez-Valera F (1999), “Use of 16S-23S sibosomal gens spacer region in studies of prokaryotic diversity”, J Microbiol Methods 36(1-2): 55-64.
18. Jones AL, Brown JM, Mishara V, Perry JD, Steigerwalt AG, Goodfellow M (2004), “Rhodococcus gordiniae sp. Nov, an actinomycete isolate from clinical material and phenolcontaminate soil”, Int J Syst Evol Microbiol 54(2): 407- 411
19. Kästner M, Breuer-Jammali M, Mahro B (1998), “Impact of innoculation protocols, salinity anh pH on the degradation of polycyclic aromatic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hydrocacbons (PAH) and survival of PAH – degrading bacteria introduced into soil”, Appl Environ Microbiol 64(1): 359 – 362.
20. Katayama-Hirayama K, Tobita S and Hirayama K (1991), “Metabolic pathway of phenol in Rhodotorula rubra”, J Gen Appl Microbiol 37(4): 379-388.
21. Koboyashi H and Rittman B E (1982) “Microbial removal of hazardous organic compounds’’, Environ Sci Technol 16(3): 170-183.
22. Komacova E, Paca J, Klapkova E (2003), “Phisiological changes of Candida tropicalis population degrading phenol in fed batch reactor”, Braz Arch Biol Technol 46(4): 375-421.
23. Lack A and Fuchs G (1992), “Carboxylation of phenyl phosphate by phenol carboxylase, an enzyme system of anaerobic phenol metabolism”, J Bacteriol
174(11): 3629-3636.
24. Lack A and Fuchs G (1994) “Evidence that phenol phosphorylation to phenol phosphate is the first step in anaerobic phenol metabolism in a denitritying
Pseudomonas sp”, Arch Microbiol 161(2): 132-139.
25. Laine M, Jorgensen K (1996), “Straw compost and bioremediated soil as inocula for the bioremedation of chlorophenol contaminated soil”, Appl Environ Microbiol 62(5): 1507-1513.
26. Lazarova V, Manem J (2000), “Innovative biofilm treatment technologies for