Trong khuôn khổ của ựề tài chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên cứu sau:
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất ựến chuột mẹ mang thai thông qua các chỉ tiêu
+ Thời gian mang thai
+ Triệu chứng, bệnh tắch (nếu có) + Tỷ lệ sảy thai
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất ựến khả năng sinh sản và nuôi con của chuột cái
+ Tổng số chuột con ựược sinh ra + Tỷ lệ ựực/cái
+ Tỷ lệ sống
+ Khối lượng chuột sơ sinh
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất ựến sự sinh trưởng và phát triển của chuột con F1
+ Khối lượng cai sữa và tách mẹ (21 ngày tuổi) và thời ựiểm kết thúc tiền trưởng thành (41 ngày tuổi)
+ Khối lượng của các tuyến nội tiết-cơ quan tiết hormone (Tuyến yên, tuyến giáp, tuyến thượng thận, gan, lách, thận) của chuột cái, chuột ựực F1 trưởng thành
+ Khối lượng của một số cơ quan thuộc hệ sinh sản chuột cái và chuột ựực F1 trưởng thành (tử cung, buồng trứng, tinh hoàn)
+ Biến ựổi vi thể của buồng chứng , tử cung chuột cái F1 trưởng thành
3.3. Nguyên liệu
3.3.1. Hóa chất: 17α-ethynylestradiol (EE), bisphenol A (BPA), và 4-
nonylphenol (NP) do hãng Sigma-Aldrich (St Louis, Mỹ) cung cấp; 4-tert Octylphenol (OP) của hãng Fluka Chemie (Seoul, Hàn Quốc); Isobutylparaben (IBP) của hãng Tokyo Kasei Co, Ltd (Tokyo, Nhật Bản).
Tất cả các hóa chất ựược hòa tan trong ethanol và bảo quản ở nhiệt ựộ 4oC
ựể tránh ô nhiễm.
3.3.2. động vật thắ nghiệm:
Chuột bạch Swiss-Albino, ựược mua từ Viện Nghiên cứu Thú y Quốc gia (Hà Nội, Việt Nam) ựạt tiêu chuẩn thắ nghiệm:
+ Chuột cái: 8 tuần tuổi, chuột khỏe mạnh, mặt nhỏ, mông nở, lông mượt, người thon dài, có năm ựôi vú cân ựối, nặng 20 ựến 22gam
+ Chuột ựực: 10 tuần tuổi, chuột khỏe mạnh, mặt to, bốn chân chắc, vai nở, lông mượt, người cân ựối, nặng 22 ựến 24gam
Chuột ựược nuôi trong lồng polycarbonate trong môi trường có kiểm soát thời gian chiếu sáng 12 giờ sáng/12 giờ tối, ựược ăn thức ăn viên không chứa ựậu nành (Trung tâm CIMADE, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung
ương, Việt Nam) và cho uống nước theo nhu cầu, với nhiệt ựộ 20-240C và
ựộ ẩm tương ựối 40-50%. Những con chuột ựực và cái ựược ghép ựôi với nhau, sau khi cho giao phối thì chuột cái ựược kiểm tra liên tục (4 tiếng một
lần) và ựược tách ra khi chúng bắt ựầu mang thai. Sự hiện diện của nút âm ựạo và của tinh trùng trong dịch tiết âm ựạo ựược tắnh là ngày mang thai ựầu tiên (gestation day 0- GD 0). Toàn bộ chuột ựang mang thai ựược phân thành 11 nhóm ( 4 chuột / nhóm), ựảm bảo sự ựồng ựều về khối lượng cơ thể giữa các nhóm. Quá trình tiến hành các thắ nghiệm trên ựộng vật ựược tuân thủ theo tiêu chuẩn của American Veterinary Medical AssociationỖs (AVMA) Council on Research Guidelines on Euthanasia techniques [AVMA Guidelines on Euthanasia (Formerly Report of the AVMA Panel on Euthanasia), June, 2007].
3. 4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Công thức phối hợp hoạt chất
- Các hoạt chất kết hợp: BPA + NP; BPA + OP; BPA + IBP
- Nồng ựộ: 500; 50; 5 mg/ kg thể trọng/ ngày. Các hóa chất ựược phối hợp với tỷ lệ 1:1.
Hình 3.2: Các hoạt chất kết hợp và ựối chứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- đối chứng âm (dung dịch Natri Clorua 9%0); đối chứng dương (17α- ethynylestradiol, EE)
3.4.2. Bố trắ thắ nghiệm
- Chuột cái vào ngày chửa ựầu tiên, bắt ựầu ựược tiêm hóa chất. - Tổng số nhóm thắ nghiệm: 11 nhóm
- Tổng số chuột thắ nghiệm: 11 nhóm x 4 chuột chửa/ nhóm = 44 chuột cái có chửa
- Liều tiêm: 0.1 ml/ con/ ngày, tiêm dưới da ở tất cả các loại hóa chất dạng kết hợp
- Thời gian tiêm: Chuột cái từ ngày chửa thứ nhất ựến ngày chửa thứ 21
- Thời gian theo dõi thắ nghiệm: Chuột F1 (ựực và cái) từ 1 ngày tuổi ựến 41 ngày tuổi
- Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
3.4.3. Phương pháp theo dõi các chỉ số
- Chuột mẹ ựược cân trọng lượng hàng ngày ựể xác ựịnh lượng hóa chất ựưa vào cơ thể, ựồng thời quan sát và ghi chép các biểu hiện bệnh lý (thời gian mang thai, sảy thai, tỷ lệ ựẻ non).
- Vào ngày ựẻ thứ nhất, kiểm tra tổng số con non ựược sinh ra/ ổ, số con sống/ ổ, tỉ lệ ựực cái/ ổ, trọng lượng con non.
- Từ ngày 1- 21 sau ựẻ, kiểm tra hàng ngày các biến ựổi của con non (khả năng sống, trọng lượng con non vào ngày tách mẹ).
- Từ ngày 22- 40 sau ựẻ, kiểm tra các biến ựổi của con cái non (thời ựiểm phát dục).
- Ngày 41 sau ựẻ, kiểm tra trọng lượng con non, tỉ lệ sống/ ổ, mổ lấy bệnh phẩm (các tổ chức sản sinh hormone: tuyến yên, tuyến giáp trạng, lách, gan, tuyến thượng thận; các cơ quan sinh sản ựực cái: buồng trứng, tử cung, tinh hoàn), kiểm tra trọng lượng các cơ quan ựó.
- Sau ựó, các cơ quan sinh sản con cái (tử cung, buồng trứng) ựược ngâm formol 10%, ựúc khuôn paraffin, cắt tiêu bản, nhuộm hematoxyline và eosin ựể kiểm tra các biến ựổi về cấu trúc và hình thái tế bào trong các cơ quan này.
Hình3.4:Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm và các chỉ tiêu kiểm tra
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu ựược thống kê bằng phương pháp One-way ANOVA. Sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm tiêm hóa chất và các nhóm ựối chứng ựược phân tắch bằng TukeyỖs Multiple Regression Test với ựộ sai khác có ý nghĩa p < 0,05. Riêng dữ liệu tỷ lệcái/ ựực F1 ựược phân tắch bởi kiểm
ựịnh khi bình phương hàng ừ cột(Chi square test), tiếp theo là kiểm tra xác suất chắnh xác theo Fisher (FisherỖs exact probability test). Kết quả ựược thể hiện theo sai số chuẩn của giá trị trung bình(Standard error of the mean - S.E.M).
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng phối hợp của BPA và các hóa chất nghiên cứu ựến thời gian mang thai của chuột mẹ
Các hóa chất ựược sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi ựều là hóa chất gây rối loạn nội tiết và ựược xem là những chất có hoạt tắnh estrogen thấp hơn rất nhiều lần (khoảng 1/1000) so với 17β-estradiol (E2), mức ựộ của chúng là E2>NP>OP>BPA (Vo, 2010). Tuy nhiên, những hợp chất EDCs này khi kết hợp với nhau ở nồng ựộ thấp (là nồng ựộ cho phép sử dụng trong các sản phẩm công nghiệp, trong môi trường, và cuộc sống) với thời gian kéo dài vẫn chứng tỏ những tác ựộng sinh học tương tự hoạt ựộng của hormone estrogen trong cơ thể (Abaci và cs, 2009; Foster , 2008). Mặc dù ựã có một số nghiên cứu trước ựây trình bày những tác ựộng
của hóa chất BPA, NP, OP và IBP ựơn lẻ trong mô hình in vivo và in vitro
(An và cs, 2002; Vo và cs 2011; Dang và cs, 2007), nhưng những nghiên cứu về ảnh hưởng làm tăng cường hoạt ựộng bắt chước hormone estrogen khi phối hợp cùng lúc của 2 hoặc 3 chất trên ựối với cơ thể ựộng vật, ựặc biệt trong giai ựoạn mang thai còn rất hạn chế. Chúng tôi ựã tiến hành nghiên cứu những ảnh hưởng tăng cường của các hóa chất khi phối hợp (BPA+ NP, BPA+OP, BPA+IBP) tới thời gian mang thai của chuột mẹ, kết quả ựược trình bày tại Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của các hóa chất phối hợp tới thời gian mang thai của chuột mẹ
Thời gian mang thai của chuột ở các nồng ựộ (ngày)
Lô hóa
chất
5 mg/kgTT/ngày 50 mg/kgTT/ngày 500 mg/kgTT/ngày
BPA+NP 21.00 ổ 0.71 20.67ổ 0.71* 20.33ổ 0.58* BPA+OP 20.80ổ 0.45* 21.40ổ 0.55 20.67ổ 0.52* BPA+IBP 20.75ổ 0.50* 20.50ổ 0.58* 20.67ổ 0.58* VE 22.25ổ 0.50 EE 21.67ổ 0.58 a (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
p < 0.05 so với ựối chứng âm (VE) (TukeyỖs multiple regression test at p < 0.05)
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy sự tác ựộng của các hóa chất kết hợp tới thời gian mang thai của chuột mẹ bị tiêm hóa chất so với nhóm ựối chứng VE. đặc biệt ở nhóm kết hợp BPA + IBP (ở cả ba nồng ựộ) thời gian mang thai của chuột mẹ ựều giảm. Ở hai nhóm kết hợp hóa chất còn lại sự ảnh hưởng ựến thời gian mang thai của chuột mẹ tập trung ở nhóm BPA + NP có nồng ựộ 500 và 50 (mg/ kg BW/ ngày), và nhóm BPA + OP nồng ựộ 500 và 5 (mg/ kg BW/ ngày) so với chuột mẹ nhóm ựối chứng. Kết quả cho thấy thời gian mang thai của chuột mẹ giảm từ 0.85 ựến 1.87 ngày so với chuột ựối chứng.
Trong một nghiên cứu về những con chuột mang thai khi tiếp xúc với 6 loại EDCs kết hợp (như thuốc trừ sâu, epoxiconazole, mancozeb, prochloraz, tebuconazole và procymidone) quan sát thấy thời gian mang thai của con mẹ bị thay ựổi, và xuất hiện một số dị tật ở cơ quan sinh sản của con ựực (Jacobsen và cs, 2012) . Việc ựưa một hỗn hợp ựộc tắnh gồm 13 EDCs, như phthlates, thuốc trừ sâu, BPA, paraben trong thời kỳ mang thai làm ngắn thời gian mang thai của các cá thể chuột chửa, tăng ựáng kể khả năng nữ hóa, giảm trọng lượng tuyến tiền liệt, và ảnh hưởng ựến môi trường nội tiết tố ở nam giới (Christiansen và cs, 2012). Kang và cs (2002) ựã tiến hành tiêm dưới da với 100 hoặc 200 mg/kg butylparaben/ ngày cho những con chuột mang thai cũng dẫn ựến sự biến ựổi ựáng kể ở chuột mẹ trong thời gian mang thai như giảm trọng lượng, xảy thai, ựẻ non, các con chuột ựực non khi sinh ra có biểu hiện giảm về số lượng tinh trùng, trọng lượng tinh hoàn, túi tinh, và tuyến tiền liệt .Tương tự như vậy, ựã có báo cáo về việc người mẹ tiếp xúc với thuốc trừ sâu thì ựứa trẻ sinh ra sẽ bị dị tật niệu sinh dục, suy giảm chất lượng tinh dịch và tinh hoàn, tuyến tiền liệt, ung thư buồng trứng và ung thư vú ở Brazil (Koifman và cs, 2002). Như vậy các kết quả chúng tôi thu nhận ựược cũng phù hợp với các tác giả nghiêm cứu trước ựây. đồng thời, cung cấp thêm bằng chứng về tác ựộng phối hợp của các loại hóa chất môi trường có hoạt tắnh estrogen (BPA, OP, NP, IBP) ựối với cá thể ựộng vật ựang mang thai, làm ảnh hưởng ựến quá trình mang thai của con cái, cụ thể là làm biến ựổi thời gian mang thai so với lô ựộng vật ựối chứng.
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của các hóa chất ựến khả năng sinh sản và nuôi con của chuột cái
Từ các nghiên cứu trước ựây về sự có mặt của EDCs trong môi trường ựã khiến người ta lo lắng, bởi vì EDCs hoặc các biến thể của chúng có phạm vi di chuyển rất rộng. Một số EDCs phân rã khá nhanh trong môi
trường, nhưng nhiều chất khác lại khá bền vững và chắnh chúng là những chất ựáng quan tâm nhất. Ngày càng có thêm nhiều bằng chứng về sự phân bố rộng khắp và bền vững của EDCs, chẳng hạn, người ta ựã tìm thấy chlor hữu cơ với hàm lượng ựáng kể trong một số loài ựộng vật như gấu ở Bắc cực, ựược cho là có nguồn gốc từ một bãi chôn lấp rác thải ựộc hại ở Hoa Kỳ. Các EDCs tắch tụ dần theo con ựường sinh học trong chuỗi thức ăn, trong các sản phẩm ựộng vật như mỡ, cá và sữa. Ngoài ra, có nhiều bằng chứng cho thấy EDCs tác ựộng tiêu cực ựến khả năng sinh sản, tăng trưởng và phát triển của một số loài ựộng vật hoang dã. Các nhà khoa học cho rằng EDCs có khả năng gây ra những tác hại như: Suy giảm khả năng sinh sản, gia tăng các bệnh về ựường sinh sản, dậy thì sớm ở các cá thể cái, giảm số lượng sinh các cá thể ựực, dị dạng cơ quan sinh sản ở các cá thể ựực. để tìm hiểu sâu hơn về những tác ựộng bất lợi của các loại hóa chất môi trường có hoạt tắnh sinh học (BPA, NP, OP, IBP) khi phối hợp với nhau ựối với cá thể mang thai, ựặc biệt những biểu hiện bất thường ở những cá thể con ựược sinh ra từ những con mẹ bị phơi nhiễm bởi những hóa chất này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất phối hợp (BPA+ NP, BPA+OP, BPA+IBP) tới tổng số chuột con F1, tỷ lệ sống sót, và tỷ lệ cái/ ựực của chuột thế hệ F1, và khối lượng của chuột sơ sinh vào ngày ựầu tiên. Kết quả ựược trình bày tại Bảng 4.2, và Hình 4.1.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng phối hợp của các hóa chất (BPA+ NP, BPA+OP, BPA+IBP) tới tổng số chuột con F1, tỷ lệ sống sót, và tỷ lệ cái/ ựực của
(Tiếp Bảng 4.2.)
a
p < 0.05 so với ựối chứng âm (VE) (TukeyỖs multiple regression test at p < 0.05)
b
Qua bảng 4.2 ta thấy sự kết hợp của các EDCs làm tăng số lượng chuột con bị chết sau khi sinh, dù những tác ựộng này là không nhiều. đặc biệt, hơn một nửa chuột con chết chỉ sau một ngày ở lô hóa chất kết hợp BPA + OP liều thấp nhất (chỉ có 45, 83 % sống sót sau khi sinh). điều này chứng tỏ các EDC mặc dù có hoạt tắnh estrogen thấp, nhưng khi kết hợp với nhau ở liều thấp trong thời gian kéo dài cũng có thể gây ảnh hưởng ựến sức sống của con con. Những ảnh hưởng mà chúng tôi quan sát ựược ở chuột con là do tác ựộng trực tiếp của các hợp chất này lên bào thai hoặc do bào thai tiếp xúc với các chất ựã bị biến ựổi của mẹ, hoặc do cả hai yếu tố trên. Ngoài ra, các chất EDCs còn ựược phát hiện có thể truyền từ mẹ sang con và có trong nước ối, máu của con sơ sinh, nhau thai, máu cuống rốn, và sữa mẹ (Vandenberg và cs, 2009). Bên cạnh ựó, còn có một sự khác biệt lớn về tỷ lệ cái/ ựực F1vào ngày PND 1 ựối với các nhóm chuột mẹ ựược tiêm hóa chất BPA + OP (50 mg/kg thể trọng/ngày), BPA + IBP (500, 5 mg/kg thể trọng/ngày) (ở mức sai khác có tắnh toán 95%). Như vậy, các hóa chất phối hợp ngoài việc có ảnh hưởng ựến thời gian mang thai của chuột mẹ bị tiêm hóa chất (kiểu sinh non), còn tác ựộng bất lợi ựến sức sống của chuột F1.
Tuy nhiên, khi kiểm tra khối lượng chuột cái và chuột ựực F1vừa sinh(giai ựoạn 1ngày tuổi), chúng tôi nhận thấy chỉ có nhóm BPA + IBP 50 (mg/ kg BW/ ngày) ở chuột cái F1 và nhóm BPA + NP (50mg/ kg BW/ ngày) ở chuột ựực F1 là có khối lượng nhỏ hơn chuột ựối chứng VE (p < 0,05). Còn lại các nhóm khác ựều không có sự chênh lệch nhiều về khối lượng ở giai ựoạn này. Kết quả ựược trình bày tại Hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả kiểm tra trọng lượng cơ thể chuột ựực và chuột cái F1 ở giai ựoạn 1ngày tuổi
Các cơ quan sinh sản rất dễ tiếp xúc với các hormone trong quá trình phát triển và hình thành giới tắnh (Hong và cs, 2003). Sự rối loạn nội tiết có thể dẫn ựến tác ựộng lớn bởi các hormon ựóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát quá trình phát triển (Colborn và cs, 1998). đối với nữ giới việc tiếp xúc với các chất có hoạt tắnh estrogen (Koninckx và cs, 1999) có liên quan tới việc ựẩy nhanh quá trình dậy thì, và sai lệch tỉ lệ giới tắnh. Thắ nghiệm cho ựộng vật gặm nhấm tiếp xúc ựồng thời với PCB và PBDE ựã xác ựịnh gây ra những ảnh hưởng về giới tắnh cho cả con ựực và con cái ở thế hệ sau (Miller và cs, 2012).Trong một nghiên cứu khác, chuột mẹ tiếp xúc với các liều BPA (2, 20, và 200 mg/kg/ngày) trong thời kỳ mang thai gây ra các thay ựổi ựặc trưng về giới tắnh, và ảnh hưởng ựến sự khác biệt và hành vi giới tắnh (Kundakovic và cs, 2012). Ngoài ra, các liều butylparaben khác nhau từ 1,4 ựến 950 mg/kg/ngày ựược sử dụng từ ngày thứ 1 ựến thứ 4 của thai kỳ có tác ựộng rõ ràng ựến các chỉ số bao gồm số lượng chuột con sinh ra, khối lượng các lứa chuột, khối lượng của mỗi chuột con, tỷ lệ sống sót ựến ngày thứ năm sau khi sinh (Ge và Chang, 2006). Theo lý thuyết hormone estrogen ựóng vai trò quan trọng trong việc ựiều chỉnh tốc ựộ di chuyển của phôi trong các ống dẫn trứng. Bởi vậy, estradiol ngoại sinh có thể chấm dứt sự mang thai bằng cách thay ựổi tốc ựộ di chuyển của phôi nang trong ống dẫn trứng hay trực tiếp gây nhiễm ựộc cho phôi trong giai ựoạn phân chia của quá trình phát triển phôi thai (Valbuena và cs, 2001). Việc gây rối loạn quá trình mang thai còn có thể do các hoạt ựộng trực tiếp tại tử cung, hoặc ảnh hưởng ựến biểu hiện bất thường của các gen cần thiết cho sự làm tổ (Ma và cs, 2003). Ngoài ra, sự khác biệt giữa ựực và cái là do sự trao ựổi chất EDCs ựược kiểm soát bởi nội tiết ở cả con ựực và con cái, tuy nhiên ở con chuột ựực biểu hiện này rõ ràng hơn ở chuột cái (Hiroi và cs, 2004). Tương tự, sự khác biệt giới tắnh dường như cũng biểu hiện khá sớm ở trong quá trình phát triển bào thai người, trong cơ thể phụ