2.1. Nội dung nghiờn cứu
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của húa chất và thời gian khử trựng đến tỉ lệ sống của mẫu gấc
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tỏi sinh chồi gấc
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của cỏc chất kớch thớch sinh trưởng đến khả năng nhõn nhanh chồi cõy gấc
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của cỏc chất kớch thớch sinh trưởng đến khả năng ra rễ
- Nghiờn cứu loại giỏ thể phự hợp cho sự thớch ứng cõy in vitro ngoài điều kiện tự nhiờn.
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu
- Vật liệu khử trựng: Nguyờn liệu thớ nghiệm gồm đỉnh chồi hoặc đoạn thõn mang chồi nỏch của cõy cỏi giụ́ng Gấc Nếp trồng tại Thái Nguyờn.
- Phương phỏp xử lý mẫu: Đỉnh sinh trưởng của cõy gấc được rửa sạch bằng nước rửa Sunlight dưới vũi nước nhiều lần. Sau đú khử trựng mẫu bằng hoỏ chất khử trựng trong box an toàn cấp 1. Kết thỳc khử trựng cắt mẫu thành những đoạn cú kớch thước 2cm, rồi cấy vào mụi trường vào mẫu để đỏnh giỏ hiệu quả khử trựng và giỳp mẫu ổn định trước khi nuụi cấy.
- Hoỏ chất khử trựng: H2O2 và HgCl2
- Mụi trường nuụi cấy: MS (Murashige & Skoog , 1962) [20], bổ sung 30g Saccarose/lớt; 5,7g agar/lớt; 100mg inositol/l, pH = 5.6.
- Cỏc cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 mẫu/1 cụng thức.
- Cỏc thớ nghiệm tiến hành
Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và thời gian khử trựng đến tỷ lệ sống của mẫu gấc (Sau 15 ngày nuụi cấy)
Giai đoạn tỏi sinh chồi Mẫu: Ngọn gấc Giai đoạn khử trựng
( Giai đoạn vào mẫu)
Giai đoạn nhõn nhanh cụm chồi Mẫu: Chồi invitro
Giai đoạn tạo cõy hoàn chỉnh
Mẫu: Chồi in vitro Giai đoạn vườn ươm
Mẫu: Cõy con in vitro
Cõy gấc nuụi cấy mụ
Cụng thức thớ nghiệm Thời gian và nồng độ khử trựng Cụng thức thớ nghiệm Thời gian và nồng độ khử trựng CT1 Khụng xử lý CT6 20% + 10 phỳt CT 2 15% + 10 phỳt CT 7 20% + 15 phỳt CT 3 15% + 15 phỳt CT 8 20% + 20 phỳt CT 4 15% + 20 phỳt CT 9 20% + 25 phỳt CT5 15% + 25 phỳt
Thớ nghiệm 2: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trựng đến tỷ lệ sống của mẫu gấc (Sau 15 ngày nuụi cấy)
Cụng thức thớ nghiệm Thời gian và nồng độ khử trựng Cụng thức thớ nghiệm Thời gian và nồng độ khử trựng CT1 Khụng xử lý CT6 0,15% + 5 phỳt CT 2 0,1% + 5 phỳt CT 7 0,15% + 10 phỳt CT 3 0,1% + 10 phỳt CT 8 0,15% + 15 phỳt CT 4 0,1% + 15 phỳt CT 9 0,15% + 20 phỳt CT5 0,1% + 20 phỳt
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 15 ngày)
+ Tỷ lệ mẫu nhiễm:
Tổng số mẫu nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = 100
Tổng số mẫu nuụi cấy
+ Tỷ lệ mẫu sống:
Tổng số mẫu sống
Tỷ lệ mẫu sống (%) = 100 Tổng số mẫu nuụi cấy
+ Tỷ lệ mẫu chết
Tổng số mẫu chết
Tỷ lệ mẫu chết (%) = 100 Tổng số mẫu nuụi cấy
Mẫu nuụi cấy được sử dụng ở đõy là cỏc đỉnh sinh trưởng hoặc đoạn thõn mang chồi nỏch. Cỏc chồi này được cấy vào mụi trường tỏi sinh cú mụi trường nền là MS bổ sung 30g sucrose/l, 5,7g agar, 100mg inositol/l, pH = 5,6 và chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng là BAP, Kinetin. Cỏc cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 60 mẫu/1 cụng thức.
- Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 3: Nghiờn cứu ảnh hưởng của kinetin đến đến khả năng tỏi sinh chồi CT 1: MT nền + kinetin 0,0mg /l CT 2: MT nền + kinetin 0,5mg /l CT 3: MT nền + kinetin 1,0mg /l CT 4: MT nền + kinetin 1,5mg /l CT 5: MT nền + kinetin 2,0mg /l
Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tỏi sinh chồi
CT 1: MT nền + BAP 0,0mg /l CT 2: MT nền + BAP 0,5mg /l CT 3: MT nền + BAP 1,0mg /l CT 4: MT nền + BAP 1,5mg /l CT 5: MT nền + BAP 2,0mg /l
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 20 ngày)
Tổng số mẫu nảy chồi
+ Tỷ lệ nảy chồi (%) = 100 Tổng số mẫu đưa vào
Giai đoạn nhõn nhanh cụm chồi
- Cỏc chồi in vitro sinh trưởng và phỏt triển bình thường cú đầy đủ thõn, lỏ (Chỳ ý: là khụng bị dị dạng) được sử dụng làm vật liệu cấy chuyển sang mụi trường nhõn nhanh. Trong giai đoạn này tiến hành nghiờn cứu ảnh hưởng của
cỏc chất điều tiết sinh trưởng là BAP, Kinetin, nước dừa, IBA đến sự nhõn nhanh của chồi gấc. Mụi trường nền được sử dụng là MS bổ sung 30gram Sucrose; 5,7gram agra, 100mg inositol/l, pH = 5,6.
- Cỏc cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 120 mẫu/1 cụng thức.
Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 5: Nghiờn cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ kinetin (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,5 CT 3 1,0 CT 4 1,5 CT 5 2,0 CT 6 2,5
Thớ nghiệm 6: Nghiờn cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,2 CT 3 0,4 CT 4 0,6 CT 5 0,8 CT 6 1,0
Thớ nghiệm 7: Nghiờn cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và kinetin đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức
thớ nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l)
CT 1 BAP* 0,0
CT 3 BAP* 0,2
CT 4 BAP* 0,3
CT 5 BAP* 0,4
CT6 BAP* 0,5
Ghi chỳ: Nồng độ BAP được sử dụng trong cỏc thớ nghiệm là nồng độ cho kết quả cao nhất trong thớ nghiệm 6 và được kớ hiệu là BAP*.
Thớ nghiệm 8: Nghiờn cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và nước dừa đến hiệu quả nhõn chồi
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) CT 1 BAP* 0 CT 2 BAP* 50 CT 3 BAP* 100 CT 4 BAP* 150 CT 5 BAP* 200
Thớ nghiệm 9: Nghiờn cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhõn chồi.
Cụng thức
thớ nghiệm Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l)
CT 1 BAP* 0,0 CT 2 BAP* 0,02 CT 3 BAP* 0,04 CT 4 BAP* 0,06 CT 5 BAP* 0,08 CT6 BAP* 0,1
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 30 ngày) Tổng số chồi tạo thành
+ Hệ số nhõn = 100
Tổng số chồi nuụi cấy + Chất lượng chồi:
Chồi trung bình: Chồi hơi gầy, lỏ xanh.
Chồi kộm: Chồi gầy, lỏ xanh nhạt hoặc chồi bị dị dạng.
Tổng chiều cao chồi + Chiều cao TB của chồi(cm) = Tổng số chồi theo dừi
Giai đoạn tạo cõy hoàn chỉnh
- Mẫu nuụi cấy: Chồi cõy gấc khoẻ mạnh cú từ 3 - 5 lỏ thu được từ quỏ trỡnh nhõn nhanh.
- Mụi trường nền được sử dụng là 1/2 MS bổ sung Succrose 30g/lớt; aga 5,7g /lớt, 100mg inositol/l, pH = 5,6.
- Cỏc cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, 90 mẫu/1 cụng thức.
- Cỏc thớ nghiệm tiến hành:
Thớ nghiệm 10: Nghiờn cứu ảnh hưởng của NAAđến hiệu quả ra rễ
Cụng thức thớ nghiệm Nồng độ NAA (mg/l) CT 1 0,0 CT 2 0,1 CT 3 0,2 CT 4 0,3 CT 5 0,4 CT 6 0,5
Thớ nghiệm 11: Nghiờn cứu ảnh hưởng của IBAđến hiệu quả ra rễ
Cụng thức
thớ nghiệm Nồng độ IBA (mg/l)
CT 1 0,0
CT 2 0,1
CT 4 0,3
CT 5 0,4
CT 6 0,5
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 30 ngày)
Tổng số chồi ra rễ + Tỷ lệ chồi ra rễ () = 100 Tổng số chồi cấy Tổng số rễ ra + Số rễ /cõy (rễ) = Tổng số cõy tạo thành
Giai đoạn vƣờn ƣơm
- Vật liệu là cõy gấc con sau nuụi cấy mụ.
- Phương phỏp ra cõy: Trước khi đưa cõy con ra trồng ngoài tự nhiờn người ta thường tiến hành huấn luyện để cõy quen dần với điều kiện mụi trường bờn ngoài. Thời gian này cú thể kộo dài khoảng 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thớch nghi của cõy. Cõy con trong bỡnh cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bỏm vào vì chỳng thường là mụi trường thớch hợp cho nấm bệnh phỏt triển hoặc cụn trựng tấn cụng. Tiếp đú ngõm cõy vào nước để trỏnh hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giỏ thể.
- Chế độ chăm súc cõy con trong giỏ thể: Trong thời gian cõy ở trong giỏ thể, hàng ngày tiến hành tưới phun bằng nước sạch 2 lần/ngày (giữ ẩm độ giỏ thể khoảng 75% - 80%).
- Cỏc cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 60 mẫu /CT.
Thớ nghiệm 12: Nghiờn cứu loại giỏ thể phự hợp cho sự thớch ứng cõy in vitro ngoài điều kiện tự nhiờn
CT2: Đất phự sa
CT3: Đất phự sa : Trấu hun = (2:1) CT4: Cỏt : đất : trấu hun = (1: 2: 1)
Thớ nghiệm được bố trớ ngẫu nhiờn 3 lần lặp lại.
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi ( theo dừi sau 45 ngày)
Tổng số cõy sống
+ Tỷ lệ cõy sống () = 100
Tổng số cõy ra bầu
2.3. Xử lý số liệu
- Tớnh cỏc giỏ trị trung bình được thực hiện trờn phần mềm Excel. - Xử lý số liệu bằng phần mềm IRISTAT (Cv% độ tin cậy thớ nghiệm và LSD% sự sai khỏc cú ý nghĩa) [12].
2.4. Điều kiện thớ nghiệm
2.4.1. Thớ nghiệm in vitro
Cỏc thớ nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhõn tạo, cỏc yếu tố vật lý như: ỏnh sỏng, nhiệt độ, độ ẩm luụn được duy trì ổn định.
+ Ánh sỏng: Cỏc mẫu được nuụi cấy dưới ỏnh đốn Neon với cường độ chiếu sỏng 1500 lux, thời gian chiếu sỏng 16 giờ/ ngày.
+ Nhiệt độ: Nhiệt độ phũng nuụi cấy được duy trì trong khoảng 20 - 220C (đờm) và 25 - 270
C (ngày).
+ Độ ẩm: Phũng nuụi cấy cú độ ẩm 70% độ ẩm bóo hoà.
2.4.2. Thớ nghiệm thớch ứng cõy in vitro ngoài điều kiện tự nhiờn
Thớ nghiệm được tiến hành tại khu nhà kớnh và khu trồng thực nghiệm của Viện khoa học Sự sống - Đại học Thỏi Nguyờn.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của húa chất và thời gian khử trựng đến tỷ lệ sống của mẫu gấc đến tỷ lệ sống của mẫu gấc
Việc khử trựng mẫu là một kỹ thuật quan trọng của quỏ trỡnh nuụi cấy in vitro. Hiện nay, cú rất nhiều hoỏ chất được lựa chọn để khử trựng mẫu, mỗi loại húa chất khử trựng cú tỏc dụng tiờu diệt đối với những loại vi sinh vật (nấm, khuẩn) khỏc nhau. Tỏc dụng của mỗi loại húa chất đú đối với vi sinh vật tựy thuộc vào nồng độ và thời gian khử trựng. Vỡ vậy, việc lựa chọn loại húa chất, nồng độ và thời gian khử trựng cũng rất quan trọng. Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu chỳng tụi tiến hành thử nghiệm hai loại hoỏ chất khử trựng là oxy già (H2O2) và thuỷ ngõn clorua (HgCl2).
3.1.1. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của H2O2 đến tỷ lệ sống của mẫu gấc Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ H2O2 và thời gian khử trựng đến tỷ lệ
sống của mẫu gấc (Sau 15 ngày nuụi cấy) CT Nồng độ và thời
gian xử lý Tỷ lệ mẫu sống (%) nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu chết (%)
CT1 Khụng xử lý 0,0 100,0 0,0 CT 2 15% + 10 phỳt 4,4 87,8 7,8 CT 3 15% + 15 phỳt 6,7 83,0 10,4 CT 4 15% + 20 phỳt 11,1 75,6 13,3 CT5 15% + 25 phỳt 18,9 62,2 18,9 CT6 20% + 10 phỳt 28,9 53,3 17,8 CT 7 20% + 15 phỳt 22,2 43,3 34,4 CT 8 20% + 20 phỳt 16,7 36,7 46,7 CT 9 20% + 25 phỳt 12,2 35,2 52,6 LSD0,5 1,78 CV % 7,1
Qua bảng 3.1 và Hỡnh 3.1 chỳng tụi cú một số nhận xột như sau:
Kết quả nghiờn cứu cho thấy: Khả năng khử trựng của H2O2 ở cỏc ngưỡng nồng độ khỏc nhau là khụng giống nhau. Khi tăng nồng độ H2O2 từ 15% - 20% khả năng diệt trựng cũng tăng theo, tỉ lệ mẫu sống tăng từ 4,4% - 28,9%, đồng thời tỉ lệ mẫu nhiễm giảm từ 87,8% xuống 35,2%. Tỉ lệ mẫu sống cao nhất ở cụng thức 6 (28,9%). Tỉ lệ mẫu chết tăng dần từ cụng thức 2 đến cụng thức 9 là 7,8% - 52,6%. Khi tăng nồng độ H2O2 nhận thấy tỉ lệ mẫu nhiễm giảm nhưng tỉ lệ mẫu chết tăng do tỏc dụng phỏ huỷ tế bào của H2O2. Như vậy cụng thức cú thể sử dụng để khử trựng mẫu là H2O2 (20% + 10 phỳt).
3.1.2. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của HgCl2 đến tỷ lệ sống của mẫu gấc Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trựng đến tỷ lệ
sống của mẫu gấc (Sau 15 ngày nuụi cấy) CT Nồng độ và thời
gian xử lý nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu
Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT1 Khụng xử lý 100,0 0,0 0,0 CT 2 0,1% + 5 phỳt 91,9 5,6 2,6 CT 3 0,1% + 10 phỳt 83,7 11,1 5,2
CT 4 0,1% + 15 phỳt 30,0 58,9 11,1 CT5 0,1% + 20 phỳt 38,9 27,8 33,3 CT6 0,15% + 5 phỳt 32,2 16,7 51,1 CT 7 0,15% + 10 phỳt 35,2 17,8 47,0 CT 8 0,15% + 15 phỳt 34,1 15,2 50,7 CT 9 0,15% + 20 phỳt 6,7 16,7 76,7 LSD0,5 2,1 CV % 6,6
Kết quả nghiờn cứu cho thấy: Khả năng khử trựng bằng HgCl2 với cỏc khoảng thời gian và nồng độ khử trựng khỏc nhau cho hiệu quả khử trựng là khụng giống nhau. Nồng độ HgCl2 từ 0,1% đến 0,15% với thời gian khử trựng (từ 5 - 20 phỳt), tỉ lệ mẫu sống tăng từ 5,6% - 58,9%, tỉ lệ mẫu nhiễm giảm từ 91,9% xuống 6,7%. Tỉ lệ mẫu sống cao nhất thu được ở cụng thức 4 (58,9%) và thấp nhất ở cụng thức 2 (2,6%).Tuy nhiờn, trong số mẫu sống thu được thỡ số mẫu chết do tỏc dụng gõy độc của HgCl2 là khỏ lớn (tỉ lệ mẫu chết cao nhất ở cụng thức 9 lờn đến 76,7%). Khi tăng thời gian khử trựng thỡ tỉ lệ mẫu chết cũng tăng từ 2,6% - 76,7%.
* So sỏnh kết quả nghiờn cứu khử trựng ở 2 loại hoỏ chất (H2O2 và HgCl2) Bảng 3.3. So sỏnh kết quả nghiờn cứu khử trựng 2 loại hoỏ chất
(H2O2 và HgCl2) CT Nồng độ và thời gian xử lý Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) CT1 20% + 10 phỳt 28,9 53,3 17,8 CT 2 20% + 15 phỳt 22,2 43,3 34,4 CT 3 0,1% HgCl2 + 15 phỳt 58,9 30,0 11,1 CT 4 0,1% HgCl2 + 20 phỳt 27,8 38,9 33,3 LSD0,5 2,07 Cv % 2,9
Kết quả nghiờn cứu cho thấy, khử trựng bằng CT3: HgCl2 0,1% trong 15 phỳt cho hiệu quả khử trựng cao với tỷ lệ mẫu sống thu được chiếm tỷ lệ 58,9% và tỷ lệ mẫu chết thấp nhất là 11,1%. Cỏc CT1, CT2 và CT4 cho tỷ lệ mẫu sống dao động từ 22,2% đến 27,8% và tỷ lệ mẫu chết dao động từ 17,8% đến 34,4%. Qua đú, chỳng tụi nhận thấy cụng thức 3 (HgCl2 0,1% trong 15 phỳt) là cụng thức tốt nhất trong 4 cụng thức thớ nghiệm so sỏnh và được sử dụng chuẩn bị mẫu cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của cỏc chất kớch thớch sinh trƣởng đến khả năng tỏi sinh chồi cõy gấc đến khả năng tỏi sinh chồi cõy gấc
3.2.1. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng tỏi sinh chồi cõy gấc
Bảng 3.4. Kết quả nghiờn cứu ảnh hƣởng của kinetin đến khả năng tỏi sinh chồi cõy gấc (Sau 20 ngày nuụi cṍy)
CT Nồng độ Kinetin (mg/l) Số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu nảy chồi (chồi) Tỷ lệ nảy chồi (%) 1(Đ/c) 0,0 60 0 0 2 0,5 60 15,0 25,0 3 1,0 60 18,0 30,0 4 1,5 60 27,0 45,0 5 2,0 60 9,0 15,0 LSD0,5 2,7 CV % 6,5
Kết quả sau 20 ngày nuụi cṍy trờn mụi trường nền MS cú bổ sung kinetin được thể hiện ở bảng 3. Mụi trường bổ sung 1,5mg kinetin/l cho tỷ lệ nảy
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 T ỷ l ệ n ả y c h ồ i(% ) 1 2 3 4 5 Cụng thức thớ nghiệm Tỷ lệ nảy chồi (%)
chồi cao nhất đạt 45%. Chồi phỏt triển tốt, lỏ xanh. Khi tăng nồng độ kinetin