- Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài vi sinh vật khác nhau như tảo, động vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v.v. Nước tự nhiên có thể bị ơ nhiễm phân (faecal contamination) bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc tiếp nhận nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử dụng làm nước sinh hoạt hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao.
- Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự nhiên, việc xác định sự có mặt của vi sinh vật chỉ thị được tiến hành. Coliform được xem là vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân do:
(1) chúng thường không có mặt trong mơi trường nước tự nhiên, mơi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, trong đó có con người, (2) Chúng có khả năng sống lâu trong mơi trường nước tự nhiên hơn các lồi vi sinh vật khác có nguồn gốc từ đường ruột,
(3) đa số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây bệnh, và
(4) việc phát hiện chúng bằng kỹ thuật ni cấy khá đơn giản. Coliform là nhóm các vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, khơng sinh bào tử, và có khả năng lên men lactose sinh ra acid và giải phóng khí ở 35°C sau 48h.
Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hồn thành.
+ Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định sự có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48h ở nhiệt độ 35°C.
+ Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở thí nghiệm giả định được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví dụ: mơi trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để
xác nhận việc lên men sinh khí khơng phải do vi khuẩn Gram dương (những lồi cũng có khả năng lên men sinh khí như Clostridium và Bacillus).
+ Thí nghiệm hồn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên mơi trường ở thí nghiệm xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn để xác định chúng có phải vi khuẩn Gram âm, hình que, và khơng sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform).
- Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm lactose sinh khí bằng phương pháp số
giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable Number).
-Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính thống kê tiêu chuẩn. MPN cũng có thể được sử dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong các mẫu môi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp hoặc phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.
1. Mục đích
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN.
Định lượng sự có mặt của nhóm vi khuẩn sinh khí và acid trong mẫu nước.
2. Vật liệu và Phương pháp
Nguyên liệu và dụng cụ Mẫu: nước hồ Tiền
Môi trường lỏng Lactose nồng độ kép: 30mL Môi trường lỏng Lactose nồng độ đơn: 60mL
Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong q trình lên men Lactose.
Chuẩn bị mơi trường
Mơi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức sau:
Thành phần Peptone Lactose
Cao thịt bò Nước
PH được điều chỉnh đến 6.8±0.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo hướng dẫn trong bảng sau:
Tổ hợp ống F1 F2 F3
Lấy 90ml nước cất vào bình tam giác cùng các ống chứa mơi trường được bao gói, khử trùng bằng hơi nước bão hịa ở nhiệt độ 115°C trong vòng 40 phút.
Lấy mẫu
Mẫu: nước hồ Tiền
Mẫu nước được chuẩn bị sẵn, chứa trong các bình được khử trùng trước, có nắp kín.
Pha lỗng 10 lần mẫu nước bằng cách lấy 10ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml nước đã vô trùng ở trên.
Cấy mẫu
Trước khi cấy vào mơi trường vơ trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều để đảm bảo vi sinh vật phân bố đồng đều.
Dùng pipet 10mL cấy 10mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F1.
Dùng micropipet cấy 1 mL mãu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F2.
Dùng micropipet lấy 0.1mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F3.
Nuôi cấy
Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35°C trong 48h.
3.Kết quả thấy được sau 48h
Sau 48h, kiểm tra số lượng các ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống nhận được. Ống dương tính là ống có khí được thu trong ống durham rồi xem
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng.
Số ống dương tính trong hộp F1 là 3 (1 ống sinh 2/3 ống và1 ống gần ½ ống và 1 ống gần 1/3 ống )
è lượng sinh khí khác nhau
số ống dương tính trong hộp F2 là 3 (3 ống đều sinh 1 lượng ít khí lớn hơn 10%≈ 3mm) ; số ống dương tính trong hộp F3 là 2 (trong đó 2 ống dương tính thì 1 ống lớn hơn 10% và 1 ống≈ 1/3 ống nhỏ; và 1 ống sinh 1 lượng rất nhỏ nhỏ hơn 10%).
Ta có bộ ba số 3-3-2.
Đối chiếu bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn nhận được kết quả là: 1100 MPN/100ml
mật độ vi sinh vật Coliform trong mẫu nước ban đầu: 11000
Giới hạn MPN của mẫu nước đã pha loãng 10 lần ở độ tin cậy 95% là:150-4800 MPN/100ml
Giới hạn MPN của mẫu nước ban đầu ở độ tin cậy 95% là: 1500- 48000 MPN/100ml
4. Phạm vi áp dụng
Sử dụng xác định mật độ vi sinh vật sống, cấy 10ml, 1ml, 0,1 ml từ 1 độ pha lỗng ban đầu.
Ưu điểm:
Có khả năng áp dụng trường hợp đếm mật độ vi sinh vật có trong mẫu với mật độ vi sinh vật thấp.
Với mỗi độ pha loãng làm nhiều lần ta có thể đếm số vi sinh vật khó có khả năng phát triển trên mơi trường thạch.
Cho phép đếm số vi sinh vật chính xác, mẫu khơng cản trở đếm số lượng vi sinh vật, áp dụng với nhiều loại mẫu khác nhau: rắn, lỏng với lượng vi sinh vật trong nhiều mẫu khác nhau.
Nhược điểm:
Cho phép ước tính số lượng vi sinh vật khơng thật sự chuẩn xác .
5. Thảo luận và đánh giá
Sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị vì việc ni cấy rất đơn giản. Bài này xác định bằng cách lên men lactose sinh axit và khí.
Mơi trường chỉ thị: yếu tố lên men lactose kết hợp với ống Durham. Phương pháp này có thể áp dụng cho mẫu có mật độ vi sinh vật thấp.
26
Áp dụng định lượng vi sinh vật khơng có khả năng phát triển tốt trong môi trường thạch, tuy nhiên tốn nhiều thời gian.
Bài 5 + 6: Quan sát nấm men. Định lượng nấm men trong canh trường sử dụng buồng đếm hồng cầu.