2.1.2.1 Chỉ số khúc xạ
Mục đích: Chỉ số khúc xạ của một chất so với khơng khí là tỷ lệ của sin góc tới và sin góc khúc xạ của chum tia sang truyền từ khơng khí vào chất đó. Chỉ số khúc xạ có giá trị định tính và phát hiện tạp chất. Vì vậy xác định chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc có thể đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của tinh dầu hoa cúc
Chỉ số khúc xạ đƣợc đối chứng với nƣớc ở 25 C. Nếu chỉ số khúc xạ của nƣớc trong khoảng 1,3325 – 1,3330, khúc xạ kế có thể tin cậy.
2.1.2.2 Tỷ trọng tinh dầu
Tỷ trọng của tinh dầu đƣợc xác định bằng tỷ số giữa khối lƣợng tinh dầu và khối lƣợng nƣớc cất cùng thể tích ở một nhiệt độ nhất định. Tỷ trọng của tinh dầu so với nƣớc giúp ta xác định đƣợc cách thu tinh dầu sau khi chƣng cất và chọn thiết bị phù hợp. Tỷ trọng của tinh dầu so với nƣớc đƣợc thực hiện bằng cách xác định khối lƣợng của 1 mL nƣớc cất (m1) và 1 mL tinh dầu ở cùng nhiệt độ (m2).
32
2.1.3 Phương pháp đánh giá cảm quan và thành phần hóa học
2.1.3.1 Màu sắc và độ trong suốt
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào ống thủy tinh trong suốt, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cƣờng độ của màu và và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu còn vẫn đục và khơng trong suốt chứng tỏ cịn tạp chất và nƣớc.
2.1.3.2 Mùi và trạng thái
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi loại tinh dầu có một mùi đặc trƣng. Dựa vào mùi có thể biết đƣợc tính chất và mục đích sử dụng của tinh dầu.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20- 30 mm; cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cƣờng độ mùi (thơm dịu, nồng,...).
2.1.3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu
Thành phần hóa học của tinh dầu hoa cúc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ GC-MS tại Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
Thơng số sắc ký khí cho phân tách mẫu: Nhiệt độ buồng tiêm 280 C
Tốc độ khí mang 1,0 mL/phút sử dụng khí He Chế độ tiêm: Split
Tỉ lệ chia dòng 50:1 Nhiệt độ đầu dò 150 C Thế ion 1900 EMV
33
Bảng 2.6 Chƣơng trình nhiệt
Tốc độ tăng nhiệt (C/phút) Nhiệt độ (C) Thời gian giữ nhiệt (phút)
0 50 5
34
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát điều kiện trích ly tinh dầu bằng phƣơng pháp lơi cuốn hơi nƣớc 3.1
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng độ giảm khối lượng nguyên liệu
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung mơi và ngun liệu 1:3 Kích thƣớc ngun liệu: xay 60 giây
Độ giảm khối lƣợng nguyên liệu có ảnh hƣởng rất lớn đến q trình bảo quản và vận chuyển nguyên liệu. Thơng qua khảo sát này ta có thể xây dựng quy trình bảo quản, vận chuyển nguyên liệu.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lấy 200 g nguyên liệu tƣơi, sấy ở nhiệt độ 60C với những mốc thời gian khác nhau. Kết quả thu đƣợc ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến độ giảm khối lƣợng nguyên liệu
Thí nghiệm TN1-1 TN1-2 TN1-3 TN1-4 TN1-5
Thời gian 0 60 120 180 240
Độ giảm khối lƣợng (g) 0 26,15 68,05 105,21 132,15 Sau khi sấy các mẫu, nguyên liệu đƣợc chƣng cất ở cùng điều kiện. Kết quả thu đƣợc ở Phụ lục 1
Từ Hình 3.1, ta có thể thấy rằng lƣợng tinh dầu thu đƣợc giảm từ 0,050 đến 0,005 mL khi độ giảm khối lƣợng tăng dần từ 0 đến 132,15 g. Điều này có thể giải thích do một lƣợng tinh dầu sẽ thoát đi trong quá trình sấy. Mặt khác sau khi sấy nguyên liệu sẽ trở nên dẻo vài dai hơn, hơi nƣớc rất khó lơi cuốn tinh dầu theo. Vì vậy để thu đƣợc lƣợng tinh dầu tối đa, ta nên chƣng cất ngay sau khi thu hoạch.
35
Hình 3.1 Ảnh hƣởng của độ giảm khối lƣợng
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xay
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung môi và nguyên liệu 1:3 Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi
Trong cánh hoa cúc, tinh dầu đƣợc chứa trong các túi, sẽ rất khó để hơi nƣớc lơi cuốn tinh dầu nếu nhƣ khơng có tác động cơ học làm vỡ các cấu trúc túi đựng tinh dầu. Thơng qua khảo sát ảnh hƣởng của kích thƣớc ngun liệu ta thu đƣợc kết quả Phụ lục 2
Dựa vào Hình 3.2, có thể thấy kích thƣớc nguyên liệu ảnh hƣởng rất nhiều đến q trình trích ly tinh dầu. Khi để ngun kích thƣớc cánh hoa, tinh dầu đƣợc bao bọc bởi thành rắn chắc nên hơi nƣớc rất khó phá vỡ cấu trúc đó. Khi đó kích thƣớc ngun liệu càng nhỏ lƣợng tinh dầu thu đƣợc càng nhiều, vì vậy khi xay ở nguyên liệu ở 60 giây lƣợng tinh dầu thu đƣợc 0,050 mL cịn khơng xay thì lƣợng tinh dầu thu đƣợc chỉ 0,010 mL. Tuy nhiên khi kích thƣớc nguyên liệu quá nhỏ nguyên liệu sẽ xếp chặc hơn, hơi nƣớc khó có thể đi qua tất cả nguyên liệu và lơi cuốn tinh dầu, có thể thấy rằng xay
5 3 2 1 0.5 0 1 2 3 4 5 6 0 20 40 60 80 100 120 140 VT inh dầu × 10 2 (m L) Độ giảm khối lƣợng (g) Độ giảm khối lƣợng
36
ở 60 giây thu đƣợc nhiều hơn khi xay ở 90 giây, lƣợng tinh dầu thu đƣợc tƣơng ứng là 0,055 và 0,040. Vì thế kết quả cho thấy thời gian xay tối ƣu là 60 giây.
Hình 3.2 Ảnh hƣởng của thời gian xay
3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi và nguyên liệu
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút Nồng độ muối NaCl 10%
Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi Kết quả thu đƣợc trong Phụ lục 3
Căn cứ vào Hình 3.3, nhìn chung tỷ lệ dung môi và nguyên liệu không ảnh hƣởng nhiều đến quá trình chƣng cất, ở tỷ lệ 1:2 và 1:3 thì lƣợng tinh dầu thu đƣợc tƣơng ứng là 0,055 và 0,060 mL. Tuy nhiên lƣợng nƣớc khơng thể q ít vì hơi nƣớc giúp phá vỡ các túi tinh dầu giúp lôi cuốn tinh dầu theo, cũng nhƣ không cung cấp đủ hơi để cuốn tinh dầu đi đến ống sinh hàn. Ngồi ra điều kiện tiến hành thí nghiệm khơng cho phép tổng thể tích dung dịch và nguyện liệu cho vào bình cầu vƣợt quá 2/3 thể tích bình. Vì vậy chọn tỷ lệ 1:3 là tỷ lệ tối ƣu trong phạm vi nghiên cứu này.
1 5.5 4 0 1 2 3 4 5 6 0 20 40 60 80 100 T inh dầu (m m )
Thời gian xay (giây)
37
Hình 3.3 Ảnh hƣởng của tỷ lệ ngun liệu/dung mơi
3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl
Điều kiện khảo sát:
Thời gian trích ly: 180 phút
Tỷ lệ dung mơi và nguyên liệu 1:3 Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi Kết quả thu đƣợc ở Phụ lục 4
Từ kết quả Hình 3.4, có thể thấy lƣợng tinh dầu thu đƣợc phụ thuộc vào nồng độ dung dịch NaCl thêm vào, lƣơng tinh dầu tăng từ 0,020 mL đến 0,055 mL khi tăng nồng độ muối từ 0 đến 10% và lại giảm xuống đến 0,02 mL khi tiếp tục tăng nồng độ muối đến 20%. Thêm muối NaCl vào làm tăng độ điện ly của nƣớc giúp tinh dầu dễ khuếch tán vào trong nƣớc, làm tăng nhiệt độ sôi (hay làm giám áp suất hơi của nƣớc). Tuy nhiên khi chƣng cất với nồng độ lớn hơn, lƣơng tinh dầu thu đƣợc giảm điều này có thể giải thích do khi sử dựng muối ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngồi chứa tinh dầu bị co lại ngăn cản khuếch tán tinh dầu ra ngoài [6].
5.5 6 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 1:2 1:3 VT inh dầu × 10 2 (m L)
Tỷ lệ ngun liệu/dung mơi Tỷ lệ ngun liệu/dung mơi
38
Hình 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl
3.1.5 Khảo sát thời gian trích ly
Điều kiện khảo sát: Nồng độ muối NaCl 10%
Tỷ lệ dung mơi và ngun liệu 1:3 Kích thƣớc nguyên liệu: xay 60 giây Độ ẩm nguyên liệu: nguyên liệu tƣơi Kết quả thu đƣợc trong Phụ lục 5
Dựa vào kết quả Hình 3.5, thời gian chƣng cất càng lâu thì lƣợng tinh dầu thu đƣợc càng nhiều, lƣợng tinh dầu thu đƣợc gần nhƣ tuyến tính theo thời gian. Nhƣng càng về sau lƣợng tinh dầu thu đƣợc so với thời gian càng ít và lƣợng tinh dầu khơng cịn tăng nữa ở 240 phút với lƣợng tinh dầu tối đa là 0,06 mL. Vì vậy để thu đƣợc lƣợng tinh dầu tối đa thì thời gian chƣng cất tối ƣu là 240 phút.
2 3 5.5 4 2 0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 25 T inh dầ u ( m m ) Nồng độ NaCl (%) Nồng độ NaCl
39
Hình 3.5 Ảnh hƣởng của thời gian trích ly
Hiệu suất trích ly tinh dầu 3.2
Với điều kiện trích ly tối ƣu, kết quả thể tích tinh dầu thu đƣợc trong điều kiện này đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2. Hiệu suất trích ly tinh dầu đƣợc tính theo cơng thức 2.1
Bảng 3.2 Kết quả chƣng cất ở điều kiện tối ƣu
Thí nghiệm TN6-1 TN6-2 TN6-3
Khối lƣợng nguyên liệu (g) 200 200 200
Thời gian sấy (phút) 0 0 0
Thời gian xay (giây) 60 60 60
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:3 1:3 1:3
Nồng độ NaCl (%) 10 10 10 Thời gian chƣng cất (phút) 240 240 240 Thể tích tinh dầu (mL) 0,055 0,060 0,600 Hiệu suất (%) 0,028 0,030 0,030 0 2 2.5 3 4 5 5.5 6 6 0 1 2 3 4 5 6 7 0 50 100 150 200 250 300 T inh dầ u ( m m ) Thời gian Thời gian chung cất
40
Tính chất vật lý của tinh dầu hoa cúc 3.3
Các yếu tố mà Dƣợc Điển Việt Nam yêu cầu rất nghiêm ngặt đối với tinh dầu thiên nhiên đó là tỷ trọng, chỉ số khúc xạ, góc quay cực riêng.
Tỷ trọng của tinh dầu thƣờng nằm trong khoảng 0,85-0,95 (Có một số tinh dầu nguyên chất nặng hơn nƣớc nhƣ tinh dầu đinh hƣơng, tinh dầu quế,…). Tỷ trọng của tinh dầu có thể thay đổi theo thành phần hóa học của nó. Chỉ số khúc xạ có giá trị định tính và phát hiện tạp chất của tinh dầu. Tinh dầu thiên nhiên thƣờng có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 -1,56.
Tỷ trọng và chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc đƣợc xác định tại Phịng thí nghiệm Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Tỷ trọng của tinh dầu hoa cúc so với nƣớc ở 25 C là: 0,8845 ± 0,002. Tỷ trọng đƣợc tính theo cơng thức 2.2 với m1 =0,9175 ± 0,001; m2 = 1,0353 ± 0,001
Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc là: 1,484.
Hoa cúc có tỷ trọng và chỉ số khúc xạ tƣơng đối thấp so với các loại tinh dầu khác.
Đánh giá cảm quan và thành phần hóa học của tinh dầu 3.4
3.4.1 Cảm quan tinh dầu thu được
Tinh dầu thu đƣợc đƣợc thực hiện đánh giá cảm quan theo TCVN 8460 : 2010, kết quả thu đƣợc trong Bảng 3.3
Bảng 3.3 Các tính chất cảm quan của tinh dầu hoa cúc Màu sắc Tinh dầu hoa cúc trong suốt có màu vàng Màu sắc Tinh dầu hoa cúc trong suốt có màu vàng
Khả năng tạo nhũ Tinh dầu hoa cúc có khả năng tạo nhũ kém trong nƣớc, dễ dàng tách ra trong q trình chƣng cất lơi cuốn hơi nƣớc.
Mùi Tinh dầu có mùi thơm đặc trƣng của hoa cúc, giống mùi thảo dƣợc
41
3.4.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng GC-MS
Từ kết bảng 3.4, thành phần tinh dầu hoa cúc chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc trực tiếp gồm 32 thành phần. Trong đó thành phần chính là chrysanthenone (27,61%), trans- chrysanthenyl acetate (15,75%), selin-6-en-4 -ol (10,08%), cis-verbenyl acetate (7,24%), eucalyptol (0,63%), caryophyllene oxide (3,5%) và một số thành phần chiểm tỷ lệ nhỏ nhƣ β-selinene, β-elemene, longifolene, … Kết quả trên cũng khá tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc đây nhƣng có sự chênh lệch về thành phần. Điều này cho thấy rằng hàm lƣợng thành phần trong tinh dầu có sự khác biệt nhau tùy thuộc vào điều kiện địa lý, khí hệu và thổ nhƣỡng, .. của từng vùng canh tác.
Hai thành phần cis-verbenyl acetate (7,24%), eucalyptol (0,63%) có mặt trong hoa cúc đại đóa vàng C. morifolium, đồng thời cũng là thành phần chính của tinh dầu cây Artemisia turanica Krasnch từ Iran. Năm 2013, Behravan và các cộng sự đã nghiên
cứu thành phần hóa học, hoạt tính chống nấm và gây độc tế bào cytotoxic. Theo nghiên cứu tinh dầu Artemisia turanica chứa 1,8-cineol (40,9%), cis-verbenyl actate
(19,0%) và long não (11,0%), chống lại các chủng nấm Trichophyton rubrum,
Bảng 3.4 Kết quả phân tích thành phần của tinh dầu hoa cúc
STT Thời gian lƣu (phút) Thành phần Tỷ lệ %
1 10.688 Eucalyptol 0,63 2 12.300 trans-Chrysanthenol 1,49 3 12.384 Chrysanthenone 27,61 4 14.143 trans-Chrysanthenyl acetate 15,75 5 14.551 cis-Verbenyl acetate 7,24 6 19.053 Caryophyllene oxide 3,50 7 19.943 Selin-6-en-4𝛼-ol 10,08 8 20.069 Longifolene 4,9
42
Trichoderma reesei, Microsporum gypseum và Aspergillus niger đồng thời thể hiện sự
ức chế tăng trƣởng khối u (100%) ở nồng độ 0,02% (w/v) và cao hơn [51].
Theo nghiên cứu của Rasoanaivo và các cộng sự tinh dầu thu đƣợc từ q trình chƣng cất lơi cuốn hơi nƣớc hoa Athanasia brownii (Asteraceae), đã nghiên cứu về thành
phần hóa học bằng GC/FID và GC/MS và xác định hoạt tính sinh học, cụ thể là khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng hóa chất, bằng cách xét nghiệm DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS (2,2'-azinobis [3 ethylbenzothioline-6-sulfonic acid) và FRAP (ferric giảm khả năng chống oxy hóa), thử nghiệm khuếch tán đĩa và MTT (3- (4, 5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphe- nyltetrazolium bromide). Tinh dầu gồm phần lớn Sesquiterpen oxy (71,2%), với selin-11-en-4 -ol (24,6%), oxit caryophyllene (8,7%), humulene epoxide II (5,1%) và (E) -nerolidol (4,9%). Tinh dầu cho thấy làm giảm hoạt động Streptococci cũng nhƣ có thể trị tận gốc. Tinh dầu có tác dụng ức chế đối với các tế bào ung thƣ ở ngƣời nhƣ A375 (ung thƣ tế bào hắc tố) và HCT 116 (ung thƣ đại trực tràng) với giá trị IC50 là 19,85 và 29,53 mg/ml [50]. Nhận thấy thành phần hoa cúc vàng cũng chứa selin-6-en-4 -ol (10,08%) và caryophyllene oxide (3,5%). Do đó, có thể định hƣớng nghiên cứu về khả năng ức chế tế bào ung thƣ của tinh dầu hoa cúc về sau.
43
KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ KẾT QUẢ
Tinh dầu hoa cúc C. morifolium đƣợc thu đƣợc bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, với các điều kiện tối ƣu khối lƣợng nguyên liệu 200 g; thời gian sấy 0 phút; thời gian xay 60 giây; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:3; nồng độ NaCl 10%; thời gian chƣng cất 240 phút. Lƣợng tinh dầu thu đƣợc ở diều kiện tối ƣu là 0,055-0,060 mL tƣơng đƣơng với hiệu suất 0,028-0,030% (mL/g).
Tinh hoa cúc C. morifolium, trong suốt có màu vàng, có khả năng tạo nhũ kém trong nƣớc, dễ dàng tách ra trong q trình chƣng cất lơi cuốn hơi nƣớc, mùi thơm đặc trƣng của hoa cúc, mùi tinh dầu dai hơi giống mùi thảo dƣợc. Các chỉ số hóa lý của tinh dầu hoa cúc là: chỉ số khúc xạ của tinh dầu hoa cúc là: 1,484; tỷ trọng của tinh dầu hoa cúc so với nƣớc ở 25 C là: 0,8845 ± 0,002.
Bằng phƣơng pháp GC-MS, đã xác định đƣợc 32 hợp chất trong tinh dầu, trong đó thành phần chính là chrysanthenone (27,61%), trans-chrysanthenyl acetate (15,75%), selin-6-en-4-ol (10,08%), cis-verbenyl acetate (7,24%), eucalyptol (0,63%), caryophyllene oxide (3,5%) và một số thành phần chiếm tỷ lệ nhỏ nhƣ β-selinene, β- elemene, longifolene. Theo các nghiên cứu trƣớc đây các thành phần này có tác dụng kháng khuẩn , chống nấm và đặc biệt là ức chế các tế bào ung thƣ ở ngƣời.
Tinh dầu hoa cúc C. morifolium có tác dụng ức chế sự phát triển của 4/6 chuẩn vi
khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp trong đó có ba chủng vi khuẩn Gram dƣơng S. pyogenes, S. pneumonia, S. aureu và một vi khuẩn Gram âm H. influenza. Khả năng
kháng khuẩn của tinh dầu hoa cúc nằm trong khoảng từ vừa đến mạnh với đƣờng kính vịng kháng khuẩn từ 10 mm trở lên, trong đó khả năng kháng khuẩn cao nhất là S. pyogenes với đƣờng kính vịng kháng khuẩn 24 mm. Bên cạnh khóa luận cũng xác