Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.2.2. Xử lý đầu tôm
Thuyết minh:
Đầu tôm: nguyên liệu đầu tôm sau khi đƣợc mua về đƣợc đựng trong các tui bóng và bảo quản ở -20O
C.
Khử khoáng: Cân 100g nguyên liệu đã rã đông, đem đi ngâm trong dung dịch HCl 2% với tỉ lệ 1:3 (100g đầu tôm/ 300ml HCl 2%), trong thời gian 2 giờ. Mục đích là để khử các khoáng chất chủ yếu là các ion Ca2+
trong đầu tôm. Ngoài ra dung dịch HCl có pH<2 có thể ức chế sự hoạt động của vi sinh vật và enzyme nôi tại có trong đầu tôm.
Sau khi khử khoáng 2 giờ ta thu dung dịch khử khoáng bằng cách lọc qua rây (và vắt bã), pH tự nhiên của dịch ở vào khoảng 2-3. Điều chỉnh pH 50ml dung dịch của dung dịch lên pH=14 bằng 9ml NaOH 3N, để làm kết tủa hết các ion Ca2+
(chuyển từ dạng CaCl2 thành Ca(OH)2), sau đó đem đi ly tâm (6000 vòng, trong 10 phút), tách phần dịch trong phía trên để phân tích các chỉ tiêu.
Xay nghiền: phần đầu tôm đã đƣợc xử lý bổ sung lần 1 là 200ml nƣớc cất rồi xay ở bằng máy xay sinh tố. Sau đó dung dịch xay đƣợc lọc bằng rây. Bã tiếp tục đƣợc bổ sung 200ml nƣớc cất và xay lần 2 và lọc tiếp qua rây để thu dịch. Dịch lọc thu đƣợc qua hai lần xay đƣợc đem đi đánh giá đặc trƣng tính chất và thủy phân.
Đánh giá đặc trƣng tính chất của dịch xay: dịch xay đƣợc điều chỉnh từ pH=3-4 lên pH=7 (bằng NaOH 3N và HCl 3N) để kết tủa ion Ca2+. Dịch xay đƣợc ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu dịch và cặn thịt protein tôm.
o Phần dịch thu đƣợc lại đƣợc tiếp tục điều chỉnh lên pH=14 để kết tủa hết ion Ca2+, ly tâm ở 4OC, 6000 vòng/10 phút. Dịch đƣợc đem đi xác định hàm lƣợng protein hòa tan, khả năng chống oxi hóa của dịch protein.
o Phần cặn thịt thu hồi đƣợc đem đi xác định protein không hòa tan (bằng phƣơng pháp Kjehdahl), và xác định hàm ẩm.
o Ngoài ra hỗn hợp dịch xay đƣợc xác định protein tổng số (bằng phƣơng pháp Kjehdahl)
2.2.3. Thủy phân dịch xay
Hình 2.3: Quy trình thủy phân với các loại enzyme
Thuyết minh:
Thủy phân: hỗn hợp dịch đƣợc điều chỉnh pH cho phù hợp với từng loại enzyme đƣợc bổ sung theo nồng độ xác định, ủ ở nhiệt độ tối thích của từng enzyme bằng bể ổn nhiệt, và thời gian từ 2-8 tiếng ( theo sơ đồ bố trí thí nghiệm).
Đánh giá kết quả thủy phân theo các chỉ tiêu: hàm lƣợng protein hòa tan đƣợc tạo thành (theo phƣơng pháp biuret), khả năng chống oxy hóa thông qua đánh giá khả năng kiểm soát gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
Để thử nghiệm dùng các enzyme Alcalase, Pepsin, Protamex và Flavourzyme thủy phân hỗn hợp dịch protein thu hồi sau khi khử khoáng nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng ở các điều kiện pH, thời gian, nồng độ enzyme và nhiệt độ thích hợp.
Thí nghiệm đƣợc bố trí và xử lý trên phần mềm Design Expert phiên bản dung thử 8.01 với miền nghiên cứu cho từng loại enzyme nhƣ sau:
Bảng 2.1: Điều kiện thủy phân của các enzyme
STT Loại
Enzyme
Nhiệt độ xử lý pH Thời gian Nồng độ
1. Alcalase 60OC 7 – 9 2 – 8h 0,05 – 0,2%
2. Pepsin 37OC 2 – 4 2 – 8h 0,05 – 0,2%
3. Protamex 55OC 7 – 9 2 – 8h 0,05 – 0,2%
4. Flavozyme 55OC 5 – 8 2 – 8h 0,05 – 0,2%
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích và đánh giá
Kiểm nghiệm hóa học:
Độ ẩm đƣợc xác định bằng Phƣơng pháp sấy khô ở nhiệt độ 1000 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C ÷ 1050C đến khối lƣợng không đổi theo TCVN 3700 -1990.
Phƣơng pháp sấy ở nhiệt độ cao 100-105O C :
Nguyên lý : Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nƣớc trong mẫu thử, sau đó dựa
vào hiệu số khối lƣợng của mẫu thử trƣớc và sau khi sấy sẽ tính đƣợc hàm lƣợng nƣớc trong thực phẩm.
Dụng cụ và hóa chất :
- Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ. - Cân phân tích độ chính xác 10-4
g.
- Cốc sấy có nắp đậy (bằn sứ hoặc thủy tinh). - Đũa thủy tinh.
- Bình hút ẩm có chứa Silicagen.
Tiến hành sấy ở nhiệt độ 100-105OC :
Sấy cốc sấy đến khối lƣợng không đổi : cốc đƣợc rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 100-105OC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm cân sấy tiếp ở nhiệt độ trên làm nguội trong bình hút ẩm cân đến khi nào giữa hai lần liên tiếp sai khác không quá 5.10-4g (chứng tỏ mẫu đã sấy khô hoàn toàn).
Cân chính xác 5÷10g mẫu trong cốc đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi. Đánh tơi mẫu bằng đũa thủy tinh, dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60-80OC
trong 2 giờ. Sau đó nâng nhiệt lên 100-105OC sấy liên tục trong 3 giờ. Trong quá trình sấy cứ sau 1 giờ đảo mẫu 1 lần.
Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm cân trên cân phân tích sấy tiếp ở nhiệt độ 100-105OC đến khối lƣợng không đổi nhƣ trên.
Tính kết quả :
Độ ẩm của thực phẩm đƣợc tính theo công thức sau: XH2O
Trong đó :
X : Độ ẩm của thực phẩm
G1 : khối lƣợng cốc sấy và mẫu thử trƣớc sấy (g). G2 : khối lƣợng cốc sấy và mẫu thử sau sấy (g). G : khối lƣợng cốc sấy (g).
Hàm lƣợng Protein tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl [5]. Hàm lƣợng Protein hòa tan theo phƣơng pháp Biuret :
Phƣơng pháp Biuret:
Hàm lƣợng protein hòa tan đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp Biuret đã đƣợc Gornall AG, Bardawill CT, David MM (1949) sử dụng để xác định protein huyết thanh và Mahmoudreza Ovissipour (2009).
Nguyên lý: Trong môi trƣờng kiềm, protein kết hợp với Cu2+
thành một phức chất màu tím (phản ứng Biuret). Màu sắc của phức chất tỉ lệ với số lƣợng liên kết peptide (CO- NH-) của protein và gần nhƣ không phụ thuộc vào nồng độ tƣơng đối giữa albumin và globulin.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị thuốc thử Biuret: hòa tan 2,34375g CuSO4.5H2O và 8,0571g C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nƣớc cất, khuấy đều và cho thêm 300ml dung dịch NaOH 10%. Dung dịch trên đƣợc khuấy đều và định mức lên 1000ml bằng nƣớc cất.
- Dựng đƣờng chuẩn BSA:
Dung dịch BSA chuẩn đƣợc pha nhƣ sau: hòa tan 1g BSA vào 50ml nƣớc cất rồi khuấy đều đến khi BSA tan hết rồi định mức lên 100 ml nƣớc cất. Cuối cùng thu đƣợc dung dịch BSA có hàm lƣợng 10mg/ml.
Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự 0-5. Sau đó cho các dung dịch hóa chất vào với thể tích nhƣ sau:
Thể tích các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành so màu ở bƣớc sóng 570nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
0 1 2 3 4 5
BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Nƣớc cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4
Đƣờng chuẩn Buiret:
Đường chuẩn Biuret
y = 0,0529x + 0,0037 R2 = 0,9995 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 2 4 6 8 10 12 Hàm lượng protein (m g/m l) O D 5 7 0 n m
- Kiểm tra hàm lƣợng protein của dịch sau khi thủy phân
Cho 1ml dịch vào ống nghiệm, cho thêm 4ml thuốc thử Biuret, vortex và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, mang các mẫu so màu trên máy so màu ở bƣớc sóng 570nm. Đọc giá trị mật độ quang, dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng protein trong mẫu.
Xác định khả năng chống oxi hóa của dịch thu đƣợc bằng test kiểm soát gốc tự do DDPH và tổng năng lực khử.
Test kiểm soát gốc tự do DPPH :
Xác định khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng kiểm soát gốc tự do DDPH. Khả năng kiểm soát gốc tự do DDPH đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp đã đƣợc Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Yoshihiro Ochiai, Toshiaki Ohshima (2010) sử dụng để kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch chiết từ nấm.
Nguyên lý: DDPH là gốc tự do, dễ bị oxi hóa, có màu tím đậm. Khi có mặt chất
chống oxi hóa, gốc tự do DDPH sẽ nhận điện tử chuyển thành phân tử DDPH và mất màu tím. Nhƣ vậy, chất có hoạt tính chống oxi hóa càng cao sẽ làm mất màu dung dịch gốc tự do DDPH càng mạnh.
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch DDPH: Pha 50ml dung dịch DDPH 0.1mM bằng cách: cân 0.00197g DDPH vào 50ml Ethanol
- Dựng đƣờng chuẩn DDPH:
- Chuẩn bị 5 ống nghiệm sạch, đánh số từ 0-5. Tiếp theo cho dung dịch hóa chất vào theo bảng sau:
Thể tích của các dung dịch hóa chất cho vào ống nghiệm
- Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó tiến hành so màu ở bƣớc sóng 517nm (sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
Đƣờng chuẩn DPPH: Ống nghiệm DDPH (ml) Nƣớc cất (ml) Ethanol (ml) Hàm lƣợng (Mm) 1 1 2 1 0,1 2 0,8 2,2 1 0,02 3 0,6 2,4 1 0,04 4 0,4 2,6 1 0,06 5 0,2 2,8 1 0,08 0 0 4 0 0
- Kiểm tra khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân bằng cách cho vào ống nghiệm 0,2 ml dịch, 1,8 ml nƣớc cất, 1ml ethanol 96% và 1ml dung dịch DDPH.
- Đối với ống đối chứng thay mẫu cần đo bằng nƣớc cất.
Với mỗi mẫu đo tiến hành làm mẫu zero gồm 0,2 ml dịch cần đo, 1,8ml nƣớc và 2ml ethanol 96%.
- Các mẫu đƣợc để trong bóng tối 30 phút sau đó đo ở bƣớc sóng 517nm trên máy UV- VIS.
Dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng DDPH đã bị khử.
Tổng năng lực khử :
Mô tả: Cho vào ống nghiệm 0,1-0,2 ml mẫu cần đo tiếp đó cho 0,5 ml K 3Fe(CN)6 1% bổ sung tiếp 0,8- 0,9 ml dung dịch đệm (pH = 6,6) cho đủ 1,5 ml. Hỗn hợp đƣợc đem ủ ở 500 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C trong 20 phút.
Sau đó ta bổ sung vào ống nghiệm 0,5 ml CCl3COOH 10%. Tiếp tục bổ sung từ từ 2 ml nƣớc cất và 0,4 ml FeCl3 0,1%. Tƣơng tự đo khử gốc tự do DPPH ta tiến hành làm mẫu đối chứng nhƣng không cho mẫu đo mà thay bằng dung dịch đệm.
Khả năng khử của hỗn hợp đƣợc đo ở bƣớc sóng 700nm sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis.
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH SAU KHỬ KHOÁNG VÀ HỖN HỢP DỊCH SAU XAY:
Hỗn hợp dịch thu đƣợc theo quy trình gồm có hai loại: hỗn hợp dịch sau khi khử khoáng và hỗn hợp dịch xay.
Hai hỗn hợp dịch thu đƣợc trên có chứa protein không hòa tan, protein hòa tan và các peptide mạch nhỏ, CaCl2, HCl dƣ và một số chất khác.
3.1.1. Đặc trƣng tính chất của hỗn hợp dịch sau khi khử khoáng
Kết quả phân tích một số tính chất đặc trƣng của dịch đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Đặc trƣng tính chất của dung dịch khử khoáng Dung dịch khử
khoáng
Hàm lƣợng protein hòa tan
(mg) Nồng độ DPPH bị khử (mM) Chỉ số OD của TNLK pH 867,092 4,648 0,0626 2-3
Dịch khử khoáng chứa một hàm lƣợng protein hòa tan rất thấp, ngoài ra còn chứa Ca(OH)2 lớn, pH=2-3 nên phải loại dịch này ra khỏi dịch này trƣớc khi xay, nếu không sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của dịch, và khả năng thủy phân của enzyme pepsin (một trong sô enzyme dung để thủy phân).
3.1.2. Đặc trƣng tính chất của hỗn hợp dịch xay trƣớc khi thủy phân
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Hỗn hợp dịch xay Hàm lƣợng protein hòa tan (mg) Nồng độ DPPH bị khử (mM) Chỉ số OD của TNLK Khối lƣợng thịt vụn protein (mg) Hàm lƣợng protein tổng số (mg) Hàm ẩm (%) 1485,8340 1,7450 0,1440 3957 5030 40,9180 Dịch thịt xay nhồi chứa 5030g protein tổng số, trong đó chỉ có 1485,834 mg lƣợng protein hòa tan và có khả năng chống oxi hóa cao, vậy dịch còn chứa lƣợng protein không hòa tan tƣơng đối lớn. Kết quả này cho thấy, cần nghiên cứu thu hồi protein có chất lƣợng này.
3.2. Phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố đến hoạt động của từng enzyme
Việc đánh giá cá yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme đƣợc phân tích trên phần mềm phần mềm Design Expert phiên bản dùng thử 8.01.
3.3.1. Phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố đến hoạt động của enzyme Alcalase
Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả hàm lƣợng protein hòa tan trong quá trình thủy phân:
Hình 3.1: Ảnh hƣởng của các yếu tố đến hàm lƣợng protein hòa tan trong quy trình thủy phân bằng enzyme Alcalase.
Theo kết quả thu đƣợc ở hình 4.4 thì chỉ có một yếu tố có ảnh hƣởng mạnh nhất đến mô hình là yếu tố C-thời gian là 44,24%.
Bảng 3.3: ANOVA của các yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng protein hòa tan trong quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase
ANOVA for selected factorial model
Source Sum of
Squares df
Mean F p-value Squares Value Prob>F
Model 900852,6 7 128693,2 6,31426 0.0037 significant A-pH 52229,89 1 52229,89 2,56263 0,1377 B-%Enzyme 7353,603 1 7353,603 0,3608 0,5602 C-Thời gian 686630,7 1 686630,7 33,68915 0,0001 AB 92357,15 1 92357,15 4,531451 0,0567 AC 26714,25 1 26714,25 1,310719 0,2766 BC 35566,32 1 35566,32 1,745041 0,2133 ABC 0,616428 1 0,616428 3,02E-05 0,9957
Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả phân tích ANOVA ở bảng 3.3. Phân tích ANOVA cho thấy số liệu thực nghiệm tuân theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính bậc một với mức có ý nghĩa đạt tới 99,63%. Thời gian (C) là yếu tố duy nhất có ảnh hƣởng đối với mô hình hồi quy tuyến tính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vì vậy ta có mô hình hồi quy tuyến tính biểu diễn hàm lƣợng protein hòa tan thu đƣợc nhƣ sau:
Y1 = -1595,2476 + 205,0814 *C Trong đó:
Y1 = Hàm lƣợng protein hòa tan C: yếu tố thời gian (h)
Mô hình hồi quy tuyến tính biểu diễn hàm lƣợng protein hòa tan tƣơng thích với thực nghiệm. Với R-Squared=0,8007, Adj R-Squared=0.6739 > Pred R-Squared=0.3555, và Adeq Precision=8.513>4. Mô hình có thể đƣợc sử dụng để điều hƣớng không gian thiết kế.
Phân tích ảnh hƣởng của yếu tố C ( yếu tố thời gian):
Hình 3.2: Mô hình biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng protein hòa tan của dịch đƣợc thủy phân bởi Alcalase ở pH=8, %Enzyme=0,125%
Theo hình 4.2 thì ở pH=8 và tỷ lệ enzyme=0,125% ( pH và tỷ lệ enzyme của thí nghiệm trung tâm) thì đƣờng dốc nhất của yếu tố thời gian có độ dốc lớn. Chính vì thế nên trong trƣờng hợp thời gian có ảnh hƣởng lớn đến khả năng thủy phân của enzyme Alcalase và ảnh hƣởng này có chiều dƣơng (+), nghĩa là thời gian thủy phân càng dài thì hàm lƣợng protein hòa tan đƣợc tạo ra do quá trình thủy phân càng lớn.
Hình 3.3: Mô hình biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng protein hòa tan của dịch đƣợc thủy phân bởi Alcalase khi tăng pH và giảm pH.
Khi tăng hoặc giảm pH môi trƣờng thì độ dốc của đƣờng dốc nhất thay đổi không đáng kể, và hàm lƣợng protein cũng không thay đổi đáng kể. Điều này chứng tỏ pH=7-9 không có ảnh hƣởng đáng kể đến sự hoạt động của enzyme Alcalase.
Hình 3.4: Mô hình biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng protein hòa tan của dịch đƣợc thủy phân bởi Alcalase khi tăng và giảm tỷ lệ enzyme
Khi tăng hoặc giảm lƣợng enzyme cho vào thủy phân thì kết quả độ dốc của thời gian và hàm lƣợng protein hòa tan thay đổi cũng không đáng kể vì vậy có thể kết luận rằng trong trƣờng hợp này tỷ lệ enzyme trong khoảng [0,05%-0,2%] không gây ảnh hƣởng đến khả năng thủy phân của enzyme Alcalase trong hỗn hợp dịch thu hồi.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả nồng độ DPPH bị khử:
Hình 3.5: Ảnh hƣởng của các yếu tố thủy phân đến nồng DPPH bị khử của dịch thủy phân bằng Alcalase
Theo hình trên thì yếu tố C – thời gian là yếu tố tác động mạnh nhất khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân (với 58,29%), tiếp đến là ABC (11,76%), A-pH(5,31%), AB(4,48%).
Bảng 3.4: ANOVA của các yếu tố ảnh hƣởng đến nồng độ DPPH bị khử tan trong quá