2.1. Chất liệu nghiên cứu
2.1.1. Bài thuốc BBT
2.1.1.1 Thành phần của bài thuốc:
Bảng 2.1. Công thức bài thuốc nghiên cứu
STT Tên vị
thuốc
Tên khoa học Liều lượng
1 Bán hạ bắc Rhizoma Pinelliae 06g
2 Cam thảo Radix Glycyrrhizae 02g
3 Phục linh Poria 04g
4 Trần bì Pericarpium Citri reticulatae perenne 04g 5 Bạch truật Rhizoma Atractylodis macrocephalae 12g
6 Thiên ma Rhizoma Gastrodiae elatae 04g
7 Sinh khương Rhizoma Zingiberis 1 lát
(4g)
8 Đại táo Fructus Zizyphi jujubae 2 quả
(12g)
Các vị dược liệu trong bài thuốc được dùng dưới dạng nguyên liệu khô và đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
Thuốc được sắc theo phương pháp YHCT bằng máy sắc thuốc theo công nghệ Hàn Quốc, cơ đặc cách thủy được dịch chiết tồn phần trong nước, tỉ lệ 2: 1. Như vậy, lượng dược liệu trong dung dịch cao là 2g/ml.
2.1.1.3. Dạng bào chế:
Bài thuốc được bào chế dưới dạng cao lỏng toàn phần trong nước tỉ lệ 2:1 (2 gam dược liệu / 1ml cao lỏng), đóng túi 150 ml/ túi.
2.1.1.4. Nơi sản xuất thuốc:
Thuốc được bào chế tại khoa Dược Bệnh viện Tuệ Tĩnh – Học viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam theo kỹ thuật chế biến và bào chế đông dược.
2.1.2. Phương tiện và kỹ thuật được sử ng trong nghiên cứu:
2.1.2.1. Hoá chất phục vụ nghiên cứu
- Poloxamer 407 (P-407) của Hàn Quốc. - Atorvastatin viên nén 20 mg (Ấn Độ).
- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hố trong máu: cholesterol tồn phần, TG, LDL-C, HDL-C của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo).
2.1.2.2. Máy móc phục vụ nghiên cứu
+ Máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy). + Kính hiển vi điện tử Nhật.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: - Địa điểm nghiên cứu:
Các nghiên cứu thử độc tính cấp và tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên mơ hình nội sinh đều được tiến hành tại Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội.
Các xét nghiệm sinh hoá, định lượng các chất trong các nghiên cứu trên đều được thực hiện tại phịng xét nghiệm, Bộ mơn Dược lý – Đại học Y Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 9/ 2011 đến tháng 4/ 2012.
2.3. Đối tượng nghiên cứu: Động vật thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoẻ mạnh, cả hai giống trọng lượng trung bình 20 ± 2g do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.
Động vật thực nghiệm được nuôi 3 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn riêng cho từng loại (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN cung cấp) tại phịng thí nghiệm của bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Liều dùng thông thường trên người là 1 thang/24 giờ, mỗi thang chứa 48 gam dược liệu, một người trung bình cân nặng 50 kg . Do đó, liều dùng trung bình trên người là xấp xỉ 1g/kg thể trọng/24 giờ. Ngoại suy từ liều dùng trên người cho các súc vật thử nghiệm như sau:
Liều dùng trên chuột nhắt (hệ số 10) tương ứng với liều điều trị trên người: 10 g/kg thể trọng chuột/ 24 giờ.
2.4.1. Đánh giá độc tính cấp
Xác định LD50 của trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon.
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lơ chuột nhắt trắng, mỗi lơ ít nhất 10 con, được uống mẫu thuốc nghiên cứu cao lỏng BBT theo liều tăng dần. Tìm liều cao nhất khơng gây chết chuột (0 %), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100 %) và các liều trung gian. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lơ trong 72 giờ. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống mẫu nghiên cứu.
2.4.2. Mơ hình gây tăng lipid máu nội sinh trên chuột nhắt trắng:
Sử dụng và điều chỉnh mơ hình gây tăng lipid máu nội sinh bằng Poloxamer 407 (P - 407) theo Millar và cộng sự [ 64].
Chuẩn bị dung dịch P-407 5 % bằng cách pha 1g P-407 trong 20 ml nước muối sinh lý 0,9 %, để tủ lạnh qua đêm để làm tăng độ tan của P- 407. Kim và xylanh dùng để tiêm chuột được ngâm trong nước đá trước khi sử dụng.
Chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 12 con. Các lô được tiêm và uống thuốc như sau:
- Lô I (lô chứng sinh học): Tiêm nước muối sinh lý màng bụng với thể
tích 0,1 mL/10g thể trọng chuột, sau đó uống nước cất.
- Lơ II (lơ mơ hình P- 407): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5 % liều
250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống nước cất.
- Lô III (lô uống atorvastatin): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 5%
liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống atorvastatin liều 10mg/kg
- Lơ IV (lô uống BBT tương đương liều lâm sàng): Tiêm màng bụng
dung dịch P-407 5 % liều 250 mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống BBT liều 10g/kg.
- Lơ V (lơ uống BBT liều gấp 2 lần liều lâm sàng): Tiêm màng bụng
dung dịch P-407 5% liều 250mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống BBT liều 20g/kg .
- Lơ VI (lơ uống BBT liều gấp 5 lần liều lâm sàng): Tiêm màng bụng
dung dịch P-407 5% liều 250mg/kg (0,1 mL/10g), ngay sau đó uống BBT liều 50g/kg.
Chuột được uống nước cất và thuốc thử 5 ngày liên tục: 4 ngày trước khi tiêm màng bụng dung dịch P-407 5% liều 250mg/kg và 1 ngày sau tiêm). Ngày cuối cùng sau 24 giờ kể từ khi được tiêm P-407, tất cả các chuột bị nhịn đói qua đêm, lấy máu động mạch cảnh làm xét nghiệm định lượng TG, TC, LDL-C, HDL-C.
2.5. Xử lý số liệu
Số liệu được nhập và xử lý bằng phương pháp và thuật toán thống kê y sinh học trên phần mềm SPSS 16.
Số liệu được biểu diễn dưới dạng X± SD. Kiểm định các giá trị bằng t- test Student hoặc test trước-sau (Avant – Apres).
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Chú thích: Δ: Khác biệt so với lô chứng sinh học với p ≤ 0,05 ΔΔΔ: Khác biệt so với lô chứng sinh học với p ≤ 0,001 *: Khác biệt so với lơ mơ hình với p ≤ 0,05
CHƯƠNG III